| Project/Area Number |
23K19367
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Review Section |
0702:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
犬塚 義 京都大学, 医学研究科, 医員 (80979170)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2023-08-31 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
|
|---|
| Keywords | CRISPR screen / トランスクリプトーム解析 / HBV / gene screening |
|---|
| Outline of Research at the Start |
本研究では、HBV感染が認められた唯一のマウス肝細胞株であるAML12NTCP細胞を用いる。申請者は同細胞がHBVに感染する一方で、Hepa1-6NTCP細胞やヒトNTCP-Tgマウスから樹立された初代マウス肝細胞（PMHNTCP細胞）はD型肝炎ウイルスには感染するがHBVには感染しないことからAML12は他のマウス肝細胞株にはないHBV感染に必須のマウス因子を有していると考えた。このAML12NTCP/Cas9細胞株を用いたCRISPR genome-wide screeningによりHBVに対する宿主依存因子候補の同定が可能となり、その候補からHBV感染に必須のマウス因子を特定する。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
AML12NTCP細胞からCas9発現レンチウイルスと19,674個のマウス遺伝子を標的とするガイドRNA（gRNA）ライブラリをコードする市販のプール型レンチウイルスをそれぞれ用いてAML12NTCP/Cas9細胞株とAML12NTCP/Cas9/gRNA プール型ノックアウト（KO）細胞群を順に作成した。しかしながら、AML12細胞はLentivirus感染効率が悪く、細胞数としても5x10^8 cellsと非常に多くの細胞を用いてMOI 0.2のレンチウイルス濃度の設定でレンチウイルス感染実験を行ったが、全gRNAライブラリ78,637種類のうちの81%である63,912種類のgRNAの挿入しか確認されなかった。全遺伝子を網羅すべく、より多くのライブラリの利用を進めていくために、さらにgRNA感染効率を上げる必要があり、MOIを引き上げて感染させる準備を進めている。
また、AML12細胞に特徴的な発現遺伝子を調べるため、AML12NTCP細胞、Hepa1-6NTCP細胞、PMHNTCP細胞の3群間でRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行った。十分なReads数のもと、他２細胞と比較し、AML12に特徴的な多数の発現上昇・低下遺伝子を抽出することに成功した。今後は、上記KO実験で得られた遺伝子とトランスクリプトーム実験の結果を融合させて遺伝子を特定していきたいと考えている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
上記にも記載の通りであるが、マウス肝細胞株であるAML12細胞はLentivirus感染効率が悪く、MOI 0.2の設定では、全gRNAライブラリ78,637種類のうちの81%である63,912種類のgRNAの挿入しか確認されなかった。全遺伝子を網羅すべく、より多くのライブラリの利用を進めていくために、さらにgRNA感染効率を上げる必要があり、MOIを引き上げて感染させる準備を進めている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
レンチウイルスの感染効率を上げ、実際に挿入されたgRNA数を検討したうえで、段階を追ってHBV-RFPの感染実験へ進めていこうと考えている。
|
