| Project/Area Number |
23K19397
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
0704:Neuroscience, brain sciences, and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
櫻井 まりあ 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任研究員 (20986385)
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| Project Period (FY) |
2023-08-31 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | LRRK2 / リソソーム / αシヌクレイン / エクソソーム / パーキンソン病 / 分泌小胞 |
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| Outline of Research at the Start |
パーキンソン病病因キナーゼLRRK2は薬剤処理によるリソソーム過積載ストレス下ではリソソームに局在化し、そのキナーゼ活性依存的にリソソーム内容物を細胞外に分泌することが申請者らの先行研究より示された。また、この放出機構は分泌小胞を介していることが示唆された。本研究ではこのLRRK2依存性リソソーム分泌機構に着目し、詳細な分子機構の解明と分泌阻害剤の同定を試みる。さらに、同定した分泌阻害剤が培養細胞やマウス生体内においてαシヌクレインの細胞間伝播に与える影響を解析する。これらの検討から、LRRK2の変異がPD発症をもたらす機序の解明を試みる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、パーキンソン病(PD)病因キナーゼLRRK2に注目し、LRRK2依存的な新規細胞外放出機構の詳細な分子機構の解明とαシヌクレインの細胞間伝播に与える影響の解析を行うことで、LRRK2変異がPD発症をもたらす機序の解明を目的とする。これまでの研究から、LRRK2はクロロキン(CQ)投与などによるリソソーム過積載ストレス下においてリソソーム膜上に集積し、基質Rab10リン酸化、リソソーム酵素の細胞外放出を促進することを見出していた。CQ処理時にはLRRK2はリソソーム一重膜上に集積することからLRRK2の局在・活性制御にオートファジー分子が関与している可能性を考え、ノックダウン実験を行った結果、マクロオートファジーの開始複合体を形成するULK1, Fip200ノックダウンではLRRK2集積は抑制されなかったものの、ATG5, ATG16L1ノックダウンによっては集積が抑制された。また、V-ATPase阻害によってもLRRK2集積は抑制されたことから、LRRK2局在と活性化はCASM (conjugation of ATG8 to single membrane)に必要とされるV-ATPase-ATG16L1軸によって制御されることが示唆された。また、細胞培養上清から超遠心によって分画したエクソソーム画分では複数のエクソソームマーカーが検出され、それらはLRRK2阻害剤あるいはLRRK2やRab10のノックダウンによって減少した。また、エクソソーム画分中のカテプシンBも減少したことから、LRRK2依存的なリソソーム酵素の細胞外放出はそのほとんどがエクソソーム分泌にともなうものであることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CQ処理時のLRRK2局在・活性制御機構としてV-ATPase-ATG16L1軸が機能していることを明らかにし、論文として発表した。また、これまでに構築したスクリーニング系を用いた化合物ライブラリのスクリーニングによってCQ処理時のリソソーム酵素細胞外放出阻害剤を複数同定し、それぞれについてLRRK2の集積とキナーゼ活性への効果を検討し、クラスタリングを行った。さらに、CQ処理時に分泌されるエクソソームについてLRRK2基質やESCRT分子のノックダウン実験を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在超遠心法によって回収されたエクソソームについて粒子径と粒子量の解析を行っており、これに合わせて電子顕微鏡での撮影を行う。また、リピドミクス解析も行うことにより、CQ処理時にLRRK2依存的に分泌されるエクソソームの性状解析を行う。さらに、カテプシンBとエクソソームとの関係について、リポソームを用いたin vitro解析を進める。マウスの血中や尿中におけるエクソソーム量の変化について、エクソソーム表面マーカー認識抗体を用いたアフィニティー精製法によって定量的に検出する系を確立し、Lrrk2欠損マウスやG2019S変異型LRRK2トランスジェニックマウスに対して、同定した放出阻害剤をCQと同時に腹腔内投与し、エクソソーム量の変化を捉えることでLRRK2がエクソソーム分泌に与える影響を解析する。
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