歯周病細菌由来外膜小胞の歯周病における役割および病態解明

Research Project

Project/Area Number	23K19719
Research Category	Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	0907:Oral science and related fields
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	植村勇太徳島大学, 病院, 助教 (10980162)
Project Period (FY)	2023-08-31 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000) Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	歯周病原細菌 / 外膜小胞 / 歯肉上皮 / 歯周組織破壊
Outline of Research at the Start	歯周病は、歯周病原細菌の持続的な感染により生じる慢性炎症性疾患であり、歯周組織の免疫応答反応を介して歯周組織破壊を来す。歯周病と全身疾患の関連（歯周医学）が多く示されているが詳細な原因やメカニズムの解明には至っていない。これを解明するために歯周病原細菌が放出し、菌体固有の病原因子や核酸を豊富に含んでおり生体に分解されず安定な歯周病原細菌由来外膜小胞(OMV)に着目した。本研究では、OMVの網羅的解析により分子生物学的役割を明らかにし、この分子が歯周組織破壊への影響と全身への波及過程とそのメカニズムを解明することを目指す。
Outline of Annual Research Achievements	主要な歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalis（Pg）は、脂質二重膜から構成されるメンブレンベシクル（Outer Membrane Vesicles；OMVs）を産生し、歯周組織を構成する様々な細胞に影響を与えることが知られている。歯肉上皮細胞は細胞間で結合し細菌侵入などから生体を守るバリア機能の役割を担う。Pg-OMVs刺激による細胞間結合バリア機能破綻への影響についてはいまだ不明な点が多い。当該年度は不死化ヒト歯肉上皮細胞を用いてPg-OMVsの細胞間結合の主要な接着因子E-cadherineの発現への影響を検討したPg ATCC33277株およびジンジパイン欠失株であるPgKDP136（RGP, KGP両欠損株）、線毛欠失株Pg MPG1を用いて培養し、Pg-OMVsおよびPgKDP-OMVs、PgMPG1‐OMVsを精製した。まず、OMVのジンジパイン活性を調べるとジンジパイン欠失株、線毛欠失株よりそれぞれ精製したPg KDP-OMVs、Pg MPG1-OMVsはPg-OMVsに比べてジンジパインRgp活性が低かった。これを用いてWestern blot法、免疫染色にて検討を行った。いずれもPg-OMVs添加によりE-cadherineの顕著な蛋白減少を認めた。そのほかのOMVsでは蛋白減少は認めなかった。続いてデキストランを用いた細胞透過性実験を行った。こちらもPg-OMVs添加群がデキストランの透過性が上がった。以上のことからPg-OMVs内に含まれているジンジパインが細胞間の接着因子に影響を与えていると思われる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason Pg-OMVs刺激による細胞間結合バリア機能破綻への影響について検討を行う前に、使用するOMVsの安定的な精製を行い、内容物として含まれているジンジパインの活性に関してそれぞれの菌体と傾向が一致していることを確認する必要がありそこに時間を要した。しかしその後傾向が一致していることが確認できたため細胞に使用し、主要な接着因子であるE-cadherineに着目してWestern blot法、免疫染色を行った。OMVs添加によるE-cadherine蛋白の減少及びジンジパイン欠失株OMVsでの減少量の低下を認めた。デキストランを用いた細胞間結合の透過性実験においても同様の傾向を認めた。以上よりPg-OMVs内に含まれているジンジパインが細胞間の接着因子に影響を与えていると思われることを特定することができた。当初の実験計画よりやや遅れているが確実に進捗している。
Strategy for Future Research Activity	1）歯周病原細菌由来OMVsによる歯肉上皮細胞バリア機能破綻への影響に関して、他の主要な接着因子であるClaudin-1や細胞質膜表面にあるシグナル伝達に関与しているZO-1等を標的としてWestern blot法、免疫染色、realtimeRTPCRで検討を行う。 2）歯肉上皮細胞以外の歯周組織構成細胞に対するOMVsの影響を検討する。破骨前駆細胞へのOMVs刺激による破骨細胞誘導に関して分化マーカーであるNFATc1やDC-STAMP、CathepsinKの発現やWestern blotやreal-time PCRで解析する。また、歯肉上皮細胞と同様にPgの病原因子である線毛やジンジパイン欠損株由来のOMVや他のRed-complex菌種由来OMVを用いて検討も行う。