Structural analysis of polyketide synthase using cross-linking reaction

• Project/Area Number: 23K20282
• Project/Area Number (Other): 20H02911 (2020-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2020-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
• Research Institution: The University of Tokyo (2023-2024); Tokyo Institute of Technology (2020-2022)
• Principal Investigator: 宮永 顕正 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (10623126)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥18,070,000 (Direct Cost: ¥13,900,000、Indirect Cost: ¥4,170,000); Fiscal Year 2024: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000); Fiscal Year 2021: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2020: ¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000)
• Keywords: 微生物酵素 / 結晶構造解析 / タンパク質間相互作用 / クロスリンク / ポリケタイド合成酵素 / ポリケタイド

Outline of Research at the Start

ポリケタイド抗生物質の生合成において中心的な役割を担うポリケタイド合成酵素は、複数の触媒ドメインからなる巨大タンパク質であり、多段階の反応を触媒する。本研究では、ポリケタイド合成酵素の反応機構の全貌を明らかにすることを目的とする。独自に開発したクロスリンク反応を利用することにより、ポリケタイド合成酵素の各触媒ドメインとキャリアータンパク質との間の一時的な相互作用の解明やモジュール全体構造の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

モジュラー型ポリケタイド合成酵素 (PKS) はポリケタイド化合物の基本骨格構築を担う酵素である。その反応においては、アシル基を結合したキャリアータンパク質 (CP) がモジュール内に存在する各触媒ドメインに順番に運ばれ、一連の反応を受ける。各触媒ドメインはCPを認識して結合していると考えられ、その相互作用の詳細に興味が持たれる。
本年度は、昨年度に引き続き、抗生物質FD-891の生合成に関わるPKS GfsAのローディングモジュールの構造機能解析を検討した。GfsAのローディングモジュールは、KS様脱炭酸酵素 (KSQ) ドメインとアシル基転移酵素 (AT) ドメインとCPドメインの3つのドメインから構成される。昨年度、KSQドメインにCPドメインが結合したGfsA CP=KSQ-ATクロスリンク複合体の構造を分解能3.4 Åで決定することに成功したが、分解能が中程度であったため、相互作用界面に位置するアミノ酸残基の側鎖などの電子密度がはっきりしないところがあった。今年度は、GfsA CP=KSQ-ATクロスリンク複合体について、より高分解能の構造決定に向け、検討を進めた。ATドメインのゆらぎにより高分解能のデータが得られない可能性を考え、ATドメイン領域の配列を祖先型酵素配列に置き換えたキメラタンパク質を作製し、GfsA CP=KSQ-ATクロスリンク複合体の構造解析を検討した。その結果、分解能2.7 Åでの構造決定に成功し、KSQドメインとCPドメインの間の相互作用についてより詳細な情報を得ることができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

KSQドメインとCPドメインのクロスリンク複合体の構造をより高分解能で決定することに成功したことから、順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

引き続きPKS触媒ドメインとCPの複合体についてクロスリンク反応を検討し、クロスリンク複合体が得られれば、結晶構造解析やクライオ電子顕微鏡解析を検討する。得られた成果について、学会発表や論文発表を行う。

Research Products

• [Journal Article] Structural Basis of Amide-Forming Adenylation Enzyme VinM in Vicenistatin Biosynthesis (2023)
  • Author(s): Miyanaga Akimasa、Nagata Kenji、Nakajima Joji、Chisuga Taichi、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 18 Issue: 11 Pages: 2343-2348
  • DOI: 10.1021/acschembio.3c00517
• [Journal Article] Structure-Based Analysis of Transient Interactions between Ketosynthase-like Decarboxylase and Acyl Carrier Protein in a Loading Module of Modular Polyketide Synthase (2023)
  • Author(s): Chisuga Taichi、Murakami Satoshi、Miyanaga Akimasa、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 18 Issue: 6 Pages: 1398-1404
  • DOI: 10.1021/acschembio.3c00151
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural Basis of Transient Interactions of Acyltransferase VinK with the Loading Acyl Carrier Protein of the Vicenistatin Modular Polyketide Synthase (2023)
  • Author(s): Miyanaga Akimasa、Kawada Koichi、Chisuga Taichi、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 62 Issue: 1 Pages: 17-21
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.2c00645
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein‐Protein Recognition Involved in the Intermodular Transacylation Reaction in Modular Polyketide Synthase in the Biosynthesis of Vicenistatin (2022)
  • Author(s): Chisuga Taichi、Miyanaga Akimasa、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: 23 Issue: 14
  • DOI: 10.1002/cbic.202200200
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Recent advances in the structural analysis of adenylation domains in natural product biosynthesis (2022)
  • Author(s): Miyanaga Akimasa、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: Current Opinion in Chemical Biology Volume: 71 Pages: 102212-102212
  • DOI: 10.1016/j.cbpa.2022.102212
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Insight into the Reaction Mechanism of Ketosynthase-Like Decarboxylase in a Loading Module of Modular Polyketide Synthases (2022)
  • Author(s): Chisuga Taichi、Nagai Akira、Miyanaga Akimasa、Goto Ena、Kishikawa Kosuke、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 17 Issue: 1 Pages: 198-206
  • DOI: 10.1021/acschembio.1c00856
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Complex structure of the acyltransferase VinK and the carrier protein VinL with a pantetheine cross-linking probe (2021)
  • Author(s): Miyanaga Akimasa、Ouchi Risako、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications Volume: 77 Issue: 9 Pages: 294-302
  • DOI: 10.1107/s2053230x21008761
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Characterization of Complex of Adenylation Domain and Carrier Protein by Using Pantetheine Cross-Linking Probe (2020)
  • Author(s): Miyanaga Akimasa、Kurihara Shohei、Chisuga Taichi、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 15 Issue: 7 Pages: 1808-1812
  • DOI: 10.1021/acschembio.0c00403
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 祖先型設計法を活用したモジュール型ポリケチド合成酵素の構造解析 (2024)
  • Author(s): 千菅太一、滝浪翔太、廖増威、中野祥吾、伊藤創平、工藤史貴、江口正、宮永顕正
  • Organizer: 日本農芸化学会2024年度大会
• [Presentation] 放線菌Streptomyces graminofaciens A-8890が生産するマクロライド抗生物質の生合成におけるポリケチド合成酵素の機能構造解析とエンジニアリング (2023)
  • Author(s): 千菅太一、岸川皓典、永井瑛、坪井一馬、村上聡、臼井健郎、橋本絢子、新家一男、宮永顕正、工藤史貴、江口正
  • Organizer: 第65回天然有機化合物討論会
• [Presentation] I型ポリケチド合成酵素におけるケト合成酵素様脱炭酸酵素とアシルキャリアタンパク質間相互作用の解析 (2023)
  • Author(s): 千菅太一、宮永顕正、工藤史貴、江口正
  • Organizer: 日本農芸化学会2023年度大会
• [Presentation] マクロラクタム抗生物質クレミマイシン生合成における脱水酵素とアシルキャリアタンパク質間の相互作用解析 (2023)
  • Author(s): 小田切楓、川﨑大輔、千菅太一、宮永顕正、工藤史貴、江口正
  • Organizer: 日本農芸化学会2023年度大会
• [Presentation] マクロラクタム抗生物質ヒタチマイシンの生合成研究 (2022)
  • Author(s): 宮永顕正、高橋壯太朗、川村紘一、栗原将平、中澤雄一郎、岩井南会子、南雲陽子、臼井健郎、工藤史貴、江口正
  • Organizer: 第64回天然有機化合物討論会
• [Presentation] I型ポリケチド合成酵素ローディングモジュールにおけるケト合成酵素様脱炭酸酵素の機能構造解析 (2022)
  • Author(s): 千菅太一、永井瑛、宮永顕正、工藤史貴、江口正
  • Organizer: 日本農芸化学会2022年度大会
• [Presentation] I型ポリケチド合成酵素ローディングモジュールにおけるケト合成酵素様脱炭酸酵素の変異体解析 (2022)
  • Author(s): 永井瑛、千菅太一、宮永顕正、工藤史貴、江口正
  • Organizer: 日本農芸化学会2022年度大会
• [Presentation] I型ポリケチド合成酵素における同一モジュールのアシル基転移酵素とアシルキャリアタンパク質の相互作用解析 (2022)
  • Author(s): 伏見政人、千菅太一、宮永顕正、工藤史貴、江口正
  • Organizer: 日本化学会第102春季年会
• [Presentation] マクロラクタム抗生物質生合成におけるアデニル化酵素とアシルキャリアタンパク質間の相互作用解析 (2022)
  • Author(s): 永田健司、宮永顕正、工藤史貴、江口正
  • Organizer: 日本化学会第102春季年会
• [Presentation] マクロラクタム抗生物質ヒタチマイシン生合成におけるアデニル化酵素とキャリアタンパク質間相互認識機構 (2021)
  • Author(s): 千菅太一、宮永顕正、栗原将平、安達成彦、川崎政人、守屋俊夫、千田俊哉、工藤史貴、江口正
  • Organizer: 2020年度量子ビームサイエンスフェスタ