Selective Autophagy in a Rat Model of Nonalcoholic Fatty Liver Disease Hepatocarcinogenesis
| Project/Area Number |
23K20296
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| Project/Area Number (Other) |
20H03146 (2020-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2020-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
吉田 敏則 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (80726456)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
臼井 達哉 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (80727652)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥16,380,000 (Direct Cost: ¥12,600,000、Indirect Cost: ¥3,780,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Fiscal Year 2021: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2020: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
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| Keywords | 脂肪肝 / オートファジー / 肝前がん病変 / ラット / LC3 / NAFLD / 肝がん / 前がん病変 / 選択的オートファジー / p62 / LAMP2 / ミトファジー / ペキソファジー / AMBRA1 / 小胞体ファジー / PEX5 / FAM134B / 非アルコール性脂肪性肝疾患 / オルガノイド |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、非アルコール性脂肪性肝疾患から発生する肝がんの初期過程におけるオートファジーの役割を検討する。高脂肪飼料給餌モデル動物を用いて脂肪滴の非分布領域である肝前がん病変部をオートファジーの依存度の高い組織内飢餓領域と位置づけ、選択的オートファジーの取り込み対象の特定と取込み機序を明らかにする。比較のため、取込み対象の明確なモデル動物を種々の薬剤で誘発する。これらの肝臓から前がん病変オルガノイドを作製し、生体とオルガノイドを併用した新規のモデル研究により、脂肪肝関連初期肝発がん過程における巧みな微小エコシステムであるオートファジーの役割を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
栄養学的アプローチとしてラードを含む高脂肪飼料(45 kcal%)および超高脂肪飼料(60 kcal%)の間である高脂肪飼料(50 kcal%)を設定して、脂肪肝関連初期肝発がんモデルにおける肝部分切除の有無による前がん病変形成能の程度を比較した。前がん病変指標GST-P陽性巣の面積と、オートファゴソーム指標（LC3）、選択的オートファジー指標（p62）、リソソーム指標（LAMP2）の発現率を用いてk-means法によりクラスター解析を実施した。GST-P陽性巣の面積とLC3の発現率でクラスター解析し、陽性巣の面積あるいはLC3が高いクラスターを選抜した。さらに、LC3とP62の発現率でクラスター解析を追加したところ、オートファジー初期抑制クラスターでは，オートファジー誘導クラスターに比べて陽性巣が増加した。かつ，LC3とLAMP2の発現率の比較においても、同様の結果が確認できた。これらの反応にはオートファジー関連遺伝子および抗酸化酵素遺伝子の発現が関与していた。以上の結果、前がん病変の増大にはオートファジーの初期抑制が関連し、酸化ストレスとの影響についても考慮が必要であることが示唆された。。
毒性学的アプローチとして、動物用医薬品メトロニダゾールを用いてマイトファジー（AMBRA1）、レティキュロファジー(FAM134B)、リボファジー（NUF1P1）指標について検討した。比較のため構造類似体のジメトリダゾールを用いた。メトロニダゾールによりGST-P陽性巣の増強作用がみられたが、ジメトリダゾールでは減少傾向を示した。オートファジー指標では、群間による差は明らかではなかったが、抗酸化酵素遺伝子の発現変動がみられた。
以上のように両実験系において酸化ストレスの関与が示唆されたが、オートファジーについては関連する場合とそうでない場合があることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実験は栄養学的アプローチと毒性学的アプローチを組み合わせて行っており、本年度は、栄養学的アプローチによりオートファジー指標のクラスター解析により有用な結果が得られている。毒性学的アプローチでは、複数のオートファジー指標を組みわせているため解析に時間を要することは想定内である。マイトファジーおよびレティキュロファジー以外の選択的オートファジーはこれまで報告が少なく、引き続き、解析をすすめる予定にしている。オルガノイドについては、培養および曝露条件を含めて継続して実験を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
栄養学的アプローチにより中期肝発がんモデルラットに高脂肪飼料を給餌し、約8週間の脂肪肝関連初期肝発がんモデルを構築する。R6年度では、超高脂肪飼料（50または60 kcal%）を用いた場合の肝臓組織において網羅的遺伝子発現解析（RNA-seq）を行い、選択的オートファジーを含めた原因または関連遺伝子の探索を行う。抽出した遺伝子の発現確認（RT-PCR）を行い、免疫組織学的手法（蛍光染色含む）を用いて蛋白の局在を選択オートファジー指標（LC3、p62等）と比較し、脂肪肝および肝前がん病変形成に関わるオートファジーの関与を検討する。
前項に加え毒性学的アプローチとして、脂肪肝関連初期肝発がんモデルと並行して、医薬品や環境汚染物質等を利用し各種細胞内小器官のオートファジーが発現すると考えられる肝前がん病変モデルラットを作製し、比較解析を行う。令和6年度は、肝小核やDNA傷害を誘導することが報告されている物質を用いて、核傷害の処理過程においてヌクレオファジー（核特異的な選択的オートファジー）が生じているかどうかを検討する。選択的オートファジー指標（LC3など）および核膜成分（Laminsなど）の抗体を用いて免疫組織学的手法（蛍光染色含む）を用いて検討する。ヌクレオファジーは酵母において研究が進んでいるが、哺乳類では十分に検討されていない新規の研究計画となる。
正常の肝細胞と中期肝発がん処置肝細胞から肝由来オルガノイドを作製し、これまでにモデル動物で実施してきた各種選択オートファジーの病態形成に関わる機序解明を行う。
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Report
(4 results)
Research Products
(15 results)
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[Journal Article] Phenobarbital, a hepatic metabolic enzyme inducer, inhibits preneoplastic hepatic lesions with expression of selective autophagy receptor p62 and ER-phagy receptor FAM134B in high-fat diet-fed rats through the inhibition of ER stress.2023
Author(s)
Uomoto S, Takesue K, Shimizu S, Maeda N, Oshima K, Hara E, Kobayashi M, Takahashi Y, Shibutani M, Yoshida T.
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Journal Title
Food Chem Toxicol
Volume: -
Pages: 113607-113607
DOI
Related Report
Peer Reviewed
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[Journal Article] Featured Article：The Potential of Organoids in Toxicologic Pathology-Role of toxicologic pathologists in in vitro chemical hepatotoxicity assessment2022
Author(s)
Toshinori Yoshida, Mio Kobayashi, Suzuka Uomoto, Kanami Ohshima, Emika Hara, Yoshitaka Katoh, Naofumi Takahashi, Takanori Harada, Tatsuya Usui, Mohamed Elbadawy, Makoto Shibutani.
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Journal Title
Journal of Toxicologic Pathology, in press
Volume: 3
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Inhibition of autophagy with expression of NADPH oxidase subunit p22phox in preneoplastic lesions in a high-fat diet and streptozotocin-related hepatocarcinogenesis rat model2022
Author(s)
Ryo Ichikawa, Sosuke Masuda, Junta Nakahara, Mio Kobayashi, Risako Yamashita, Suzuka Uomoto, Ohshima Kanami, Erika Hara, Yuko Ito, Makoto Shibutani, Toshinori Yoshida
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Journal Title
Journal of Toxicological Science, in press
Volume: -
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[Journal Article] Metronidazole enhances steatosis-related early-stage hepatocarcinogenesis in high fat diet-fed rats through DNA double-strand breaks and modulation of autophagy.2022
Author(s)
Eguchi A, Mizukami S, Nakamura M, Masuda S, Murayama H, Kawashima M, Inohana M, Nagahara R, Kobayashi M, Yamashita R, Uomoto S, Makino E, Ohtsuka R, Takahashi N, Hayashi SM, Maronpot RR, Shibutani M, Yoshida T.
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Journal Title
Environ Sci Pollut Res
Volume: 29
Issue: 1
Pages: 779-789
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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