Analysis of renal factors promoting the onset and severity of non-obese type 2 diabetes

• Project/Area Number: 23K20297
• Project/Area Number (Other): 20H03157 (2020-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2020-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
• Research Institution: Nippon Veterinary and Life Science University
• Principal Investigator: 鈴木 浩悦 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (50277662)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000); Fiscal Year 2024: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2022: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2021: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2020: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
• Keywords: 糖尿病 / 腎臓 / 糖新生 / 膵島 / 腎肥大 / ラット / 細胞増殖 / D-アミノ酸酸化酵素 / D-アミノ酸 / ネフロン / インスリン抵抗性

Outline of Research at the Start

DEKの腎臓ではE2F標的遺伝子の発現が上昇し、細胞増殖活性が亢進しているが、AMPK活性化（リン酸化）は抑制されているため、AMPKアゴニストであるメトホルミンを投与し、その影響を評価する。さらに、尿細管細胞の単離培養系が確立されたため、これを用いて、尿細管細胞の増殖や遺伝子発現に対する高濃度グルコース、インスリン、D-アミノ酸、メトホルミンなどの影響を評価する。さらに、連鎖解析から12番染色体のD-アミノ酸酸化酵素以外の遺伝的要因が腎実質の増大にかかわる可能性が示唆されたため、以前行った全ゲノム解析のデータを近年アップデートされたリファレンス配列と比較し、遺伝要因を同定する。

Outline of Annual Research Achievements

1.SGLT2阻害剤により腎臓での糖の再吸収を抑制し、糖尿病の発症を阻止した動物においても腎臓サイズの増大は抑制されなかったが、持続的なインスリン投与に反応して血糖値の低下した動物では腎重量も低下していた。一方、インスリン投与に抵抗性を示した個体は、腎臓サイズの増大を示した。このことから発症個体で見られるインスリン分泌の低下は腎実質の増大を促進している可能性がある。
2.RNA-seqによる遺伝子発現解析は、糖尿病発症のDEKラットの腎臓で、細胞増殖や嚢胞腎形成に関わる遺伝子Xの発現上昇を示した。さらに、GSEA解析では、E2F標的遺伝子、G2-Mチェックポイントの進行、有糸分裂-紡錘体形成に関わる遺伝子の発現上昇が認められた。D-セリンがmTORシグナルの活性化を介して腎臓サイズの増大をもたらすことが報告されているが、mTORシグナル下流のP70S６キナーゼのリン酸化は亢進していなかったことから、DEKの腎臓サイズの増大はmTORシグナル経路以外の機構によって誘導されていると考えられる。
3.DEK系統ではピルビン酸投与で糖新生が亢進している傾向が見られ、さらに糖尿病の発症個体では肝臓の糖原性アミノ酸であるアラニンよりも、腎臓の糖原性アミノ酸であるグルタミンの投与によって、顕著な血糖値の上昇が観察された。糖新生の律速酵素の一つであるPEPCKの腎臓での発現レベルに顕著な増加は認められなかったが、腎臓サイズが増大しているため、腎臓全体で糖新生によって作られる糖の量が増加している可能性がある。
4.DEKの糖尿病発症個体と糖尿病を発症しない他系統の腎臓から尿細管上皮細胞を単離・培養し、尿細管上皮細胞のマーカー分子であるアクアポリン１の免疫染色により、細胞の性状を確認した。増殖活性の比較、インスリン、D-アミノ酸、メトホルミンの影響を調査中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

DEKの糖尿病の発症に腎臓サイズの増大が関連することが立証され、当初時間を要すると考えていた腎臓サイズの増大と関連する遺伝子変異としてD-アミノ酸酸化酵素（DAO）の欠損が既に同定されている。DEKにおいてDAOの欠損によって腎臓サイズの増大が生じるメカニズムは未だ明らかではないが、mTORの下流のP70S6キナーゼのリン酸化が亢進していないことから、D-セリンで報告されている既知のメカニズムとは異なる機構が存在することが示唆される。さらに、遺伝子の発現解析により、DEKの腎臓では細胞増殖に関連する遺伝子の発現が上昇しており、複数の個別の遺伝子の発現が顕著に変化しているため、これらの中に腎臓サイズの増大に関連する遺伝子が存在すると考えられる。一方、尿細管上皮細胞の単離・培養に時間を要したため、尿細管上皮細胞で細胞増殖が促進されるメカニズムについては、これからより詳細な研究が必要である。この点については実験の進捗がやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

DAOの欠損と腎臓サイズの増大との間の関連を明らかにするため、遺伝子発現解析で同定された腎臓で発現の変化している遺伝子について、その蛋白質としての発現動態を明らかにする。さらに、全ゲノム解析のデータを更新したリファレンスに当てることにより、DAOの欠損以外の病態に関連した遺伝子変異を同定する。尿細管上皮の単離培養系については、その方法の確立に時間を要したが、今後のところでその細胞増殖に対するインスリンやD-アミノ酸の影響を評価する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of College London/IRCCS Instituto(英国)
• [Int'l Joint Research] University of Genoa(イタリア)
• [Journal Article] Characterization of Enlarged Kidneys and Their Potential for Inducing Diabetes in DEK Rats (2021)
  • Author(s): Domon A, Katayama K, Yamada T, Tochigi Y, Suzuki H.
  • Journal Title: Biology(Basel) Volume: 10 Issue: 7 Pages: 1-16
  • DOI: 10.3390/biology10070633
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Empagliflozin ameliorates symptoms of diabetes and renal tubular dysfunction in a rat model of diabetes with enlarged kidney (DEK) (2021)
  • Author(s): Domon A, Katayama K, Sato T, Tochigi Y, Tazaki H, Suzuki H.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 16 Issue: 5 Pages: 1-16
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0251135
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cellular Expression and Subcellular Localization of Wwox Protein During Testicular Development and Spermatogenesis in Rats (2021)
  • Author(s): Mahmud MAA, Noguchi M, Domon A, Tochigi Y, Katayama K, Suzuki H.
  • Journal Title: J Histochem Cytochem Volume: 69 Issue: 4 Pages: 257-270
  • DOI: 10.1369/0022155421991629
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Loss of Wwox Perturbs Neuronal Migration and Impairs Early Cortical Development (2020)
  • Author(s): Iacomino M, Baldassari S, Tochigi Y, Kosla K, Buffelli F, Torella A, Severino M, Paladini D, Mandara L, Riva A, Scala M, Balagura G, Accogli A, Nigro V, Minetti C, Fulcheri E, Zara F, Bednarek AK, Striano P, Suzuki H, Salpietro V.
  • Journal Title: Frontires in Neuroscience Volume: 14 Pages: 644-644
  • DOI: 10.3389/fnins.2020.00644
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Clinical application of 2.16% hypertonic saline solution to correct the blood sodium concentration in diarrheic calves with hyponatremia (2020)
  • Author(s): Nakagawa M, Tsukano K, Murakami Y, Otsuka M, Suzuki K, Suzuki H
  • Journal Title: Journal of Veterinary Medical Science Volume: 82 Issue: 11 Pages: 1585-1588
  • DOI: 10.1292/jvms.20-0286
  • NAID: 130007938446
  • ISSN: 0916-7250, 1347-7439
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] WOREE症候群に見られる小脳形成不全の細胞性メカニズムの解明 (2022)
  • Author(s): 三浦 麻衣子, 村越 美咲, 栃木 裕貴, 片山 健太郎, 鈴木 浩悦
  • Organizer: 第165回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] WOREE症候群モデルラットにおけるGABAニューロンの障害と甲状腺ホルモンによる治療効果の検討 (2022)
  • Author(s): 村越 美咲, 三浦 麻衣子, 池上 亜美, 栃木 裕貴, 片山 健太郎, 鈴木 浩悦
  • Organizer: 第165回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] 椎間板の発生におけるゴルジ体タンパク質Giantinの役割 (2022)
  • Author(s): 田原 果凜, 中山 夏那, 栃木 裕貴, 片山 健太郎, 鈴木 浩悦
  • Organizer: 第165回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] 転写調節因子Thap4は精巣の正常な発達に必要である (2022)
  • Author(s): 笹島 帆正, 村上 怜, 藤井 渉, 栃木 裕貴, 片山 健太郎, 鈴木 浩悦
  • Organizer: 第165回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] 腎臓の増大を伴う糖尿病モデルラット(DEK)へのインスリン投与が腎臓に及ぼす影響 (2022)
  • Author(s): 下薗 優子、土門 綾華、丸山 純果、永江 周平、栃木裕貴、片山健太郎、鈴木浩悦
  • Organizer: 第165回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] WOREE症候群モデルラットを用いた甲状腺ホルモン投与による治療効果の検討 (2021)
  • Author(s): 泉水優志、池上亜実、栃木裕貴、片山健太郎、鈴木浩悦
  • Organizer: 第165回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] 日本獣医生命科学大学における獣医学教育改革の現状と課題 (2021)
  • Author(s): 佐々木典康、和田新平、鈴木浩悦、小山秀一
  • Organizer: 第165回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] SGLT2 inhibitor (empagliflozin) markedly improves diabetes-related phenotype in Diabetes with Enlarged Kidneys (DEK) rats (2020)
  • Author(s): Domon A, Tochigi Y, Sato T, Katayama K, Tazaki H, Suzuki H
  • Organizer: European Association for the Study of Diabetes
  • Int'l Joint Research