精子形成支持能を有する機能的精巣オルガノイドによる体外精子形成誘導法の開発

• Project/Area Number: 23K20313
• Project/Area Number (Other): 20H03437 (2020-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2020-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 佐藤 卓也 横浜市立大学, 医学部, 講師 (70599505)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000); Fiscal Year 2024: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2023: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2022: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2021: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2020: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
• Keywords: 精巣オルガノイド / セルトリ細胞 / in vitro精子形成 / 多能性幹細胞 / 精子形成 / 精巣 / 分化誘導 / 生殖巣 / 体外精子形成誘導 / オルガノイド / in vitro / 器官培養 / Treck

Outline of Research at the Start

精巣組織片を用いた器官培養法によって、マウスの精子幹細胞から精子へ至る精子形成過程の全てをin vitroで再現することが可能になった。しかし、マウス個体由来の精巣組織に依存した方法であることが、研究をすすめる上での様々な制限をもたらしている。そこで本研究は、多能性幹細胞(胚性幹(ES)細胞)から精巣オルガノイドを作製法を開発することで、精子形成の“場”を創出し、動物個体に依存しない完全なin vitro精子形成誘導システムを確立することを目的としている。

Outline of Annual Research Achievements

精巣組織片を用いた器官培養法によって、マウスの精子幹細胞から精子へ至る精子形成過程の全てをin vitroで再現することが可能になった。しかし、マウス個体由来の精巣組織に依存した方法であることが、研究をすすめる上での様々な制限をもたらしている。動物個体から得られる精巣組織を用いることなく、精子形成の“場”である精巣を創り出すため、本研究は、多能性幹細胞からの精巣オルガノイド作製法の開発を目的としている。
最近、メスの多能性幹細胞から機能的な卵巣体細胞を分化誘導する方法が報告された(Yoshino et al., 2021 Science)。この方法をもとに、オス細胞の誘導に培養条件の最適化を行うことで、オスの多能性幹細胞から精巣体細胞の誘導法を開発することに成功した。この分化誘導した精巣体細胞(fTeSLC)をsingle cell RNA sequencing法で解析した所、胎生12日に相当する精巣体細胞によって構成されていることが明らかになった。次にセルソーターを使って、このfTeSLCsからセルトリ細胞を単離し、in vitroで精細管の再構成と精子形成誘導を行なった。この再構成精細管に取り込まれた精原細胞から精子細胞の産生が観察された。さらにこの精子細胞を用いて顕微授精を行い、一匹の産仔を得ることにも成功した。以上の結果から、精巣体細胞分化誘導法は、精子形成支持能を有する機能的なセルトリ細胞の誘導が可能な培養システムであることを証明した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

多能性幹細胞から精巣体細胞を分化誘導する方法を確立した。この細胞を用いて精子形成が可能な再構成精細管の作製にも成功した。

Strategy for Future Research Activity

fTeSLCsからセルトリ細胞を分離し、この細胞が精子形成をサポートできる機能的な細胞であることを証明した。一方で、間質様細胞については、その機能は明らかになっていない。そこで次年度は、精巣へ間質細胞を移植・置換を行い、in vitro精子形成を誘導する方法を開発する計画である。それによって、誘導された間質様細胞が機能するかどうか明らかにする。
また、今年度に続き精巣体細胞様細胞から立体的な精巣オルガノイドを作製し、そこへ精子幹細胞を導入し精子形成を誘導するという、生体材料に依存しないin vitro精子形成システムの開発を行う予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Queen's University Belfast(英国)
• [Journal Article] A novel alternative method for long‐term evaluation of male reproductive toxicity and its recovery using a pre‐pubertal mouse testis organ culture system (2024)
  • Author(s): Hashimoto Kiyoshi、Arakawa Hiroshi、Imamura Rikako、Nishimura Takuya、Kitajima Satoshi、Sato Takuya、Makiyama Kazuhide、Ogawa Takehiko、Yokota Satoshi
  • Journal Title: Journal of Applied Toxicology Volume: 44 Issue: 5 Pages: 784-793
  • DOI: 10.1002/jat.4584
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Generation of rat offspring using spermatids produced through in vitro spermatogenesis._ (2023)
  • Author(s): Takafumi Matsumura, Kumiko Katagiri, Tatsuma Yao, Yu Ishikawa-Yamauchi, Shino Nagata, Kiyoshi Hashimoto, Takuya Sato, Hiroshi Kimura, Takashi Shinohara, Makoto Sanbo, Masumi Hirabayashi, Takehiko Ogawa
  • Journal Title: Scientific reports Volume: 13(1) Issue: 1 Pages: 12105-12105
  • DOI: 10.1038/s41598-023-39304-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Culture-space control is effective in promoting haploid cell formation and spermiogenesis in vitro in neonatal mice. (2023)
  • Author(s): Kiyoshi Hashimoto, Hisakazu Odaka, Yu Ishikawa-Yamauchi, Shino Nagata, Hiroko Nakamura, Hiroshi Kimura, Takuya Sato, Kazuhide Makiyama, Takehiko Ogawa
  • Journal Title: Scientific reports_ Volume: 13(1) Issue: 1 Pages: 12354-12354
  • DOI: 10.1038/s41598-023-39323-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vitro spermatogenesis in isolated seminiferous tubules of immature mice (2023)
  • Author(s): Feng Xuemin、Matsumura Takafumi、Yamashita Yuki、Sato Takuya、Hashimoto Kiyoshi、Odaka Hisakazu、Makino Yoshinori、Okada Yuki、Nakamura Hiroko、Kimura Hiroshi、Fujii Teruo、Ogawa Takehiko
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 18 Issue: 4 Pages: e0283773-e0283773
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0283773
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Temperature sensitivity of DNA double-strand break repair underpins heat-induced meiotic failure in mouse spermatogenesis (2022)
  • Author(s): Hirano Kodai、Nonami Yuta、Nakamura Yoshiaki、Sato Toshiyuki、Sato Takuya、Ishiguro Kei-ichiro、Ogawa Takehiko、Yoshida Shosei
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 5 Issue: 1 Pages: 504-504
  • DOI: 10.1038/s42003-022-03449-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Sertoli cell replacement in explanted mouse testis tissue supporting host spermatogenesis† (2021)
  • Author(s): Higuchi Kazusa、Matsumura Takafumi、Akiyama Haruhiko、Kanai Yoshiakira、Ogawa Takehiko、Sato Takuya
  • Journal Title: Biology of Reproduction Volume: 105 Issue: 4 Pages: 934-943
  • DOI: 10.1093/biolre/ioab104
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vitro reconstitution of the whole male germ-cell development from mouse pluripotent stem cells (2021)
  • Author(s): Ishikura Yukiko、Ohta Hiroshi、Sato Takuya、Murase Yusuke、Yabuta Yukihiro、Kojima Yoji、Yamashiro Chika、Nakamura Tomonori、Yamamoto Takuya、Ogawa Takehiko、Saitou Mitinori
  • Journal Title: Cell Stem Cell Volume: 28 Issue: 121 Pages: 2167-2179.e9
  • DOI: 10.1016/j.stem.2021.08.005
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Rat in vitro spermatogenesis promoted by chemical supplementations and oxygen-tension control (2021)
  • Author(s): Matsumura Takafumi、Sato Takuya、Abe Takeru、Sanjo Hiroyuki、Katagiri Kumiko、Kimura Hiroshi、Fujii Teruo、Tanaka Hiromitsu、Hirabayashi Masumi、Ogawa Takehiko
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Issue: 1 Pages: 3458-3458
  • DOI: 10.1038/s41598-021-82792-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Time-course microarray transcriptome data of in vitro cultured testes and age-matched in vivo testes (2020)
  • Author(s): Abe Takeru、Nishimura Hajime、Sato Takuya、Suzuki Harukazu、Ogawa Takehiko、Suzuki Takahiro
  • Journal Title: Data in Brief Volume: 33 Pages: 106482-106482
  • DOI: 10.1016/j.dib.2020.106482
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Spatially Fractionated Microbeam Analysis of Tissue-sparing Effect for Spermatogenesis (2020)
  • Author(s): Fukunaga Hisanori、Kaminaga Kiichi、Sato Takuya、Butterworth Karl T.、Watanabe Ritsuko、Usami Noriko、Ogawa Takehiko、Yokoya Akinari、Prise Kevin M.
  • Journal Title: Radiation Research Volume: 194 Issue: 6 Pages: 698-706
  • DOI: 10.1667/rade-19-00018.1
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Transcriptome analysis reveals inadequate spermatogenesis and immediate radical immune reactions during organ culture in?vitro spermatogenesis (2020)
  • Author(s): Abe Takeru、Nishimura Hajime、Sato Takuya、Suzuki Harukazu、Ogawa Takehiko、Suzuki Takahiro
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 530 Issue: 4 Pages: 732-738
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.06.161
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Antioxidant Vitamins and Lysophospholipids Are Critical for Inducing Mouse Spermatogenesis Under Organ Culture Conditions (2020)
  • Author(s): Sanjo H, Yao T, Katagiri K, Sato T, Matsumura T, Komeya M, Yamanaka H, Yao M, Matsuhisa A, Asayama Y, Ikeda K, Kano K, Aoki J, Arita M, Ogawa T.
  • Journal Title: The FASEB Journal Volume: online ahead of print Issue: 7 Pages: 9480-9497
  • DOI: 10.1096/fj.202000245r
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The Tissue-Sparing Effect of Spatially Fractionated X-rays for Maintaining Spermatogenesis: A Radiobiological Approach for the Preservation of Male Fertility after Radiotherapy (2020)
  • Author(s): Fukunaga Hisanori、Kaminaga Kiichi、Sato Takuya、Watanabe Ritsuko、Ogawa Takehiko、Yokoya Akinari、Prise Kevin M.
  • Journal Title: Journal of Clinical Medicine Volume: 9 Issue: 4 Pages: 1089-1089
  • DOI: 10.3390/jcm9041089
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] 胎仔マウス精巣を用いたin vitro精子形成 (2022)
  • Author(s): 西田麻由香、佐藤卓也、小川毅彦
  • Organizer: 第27回日本生殖内分泌学会学術集会
• [Presentation] 精子形成過程の体外再構築 (2022)
  • Author(s): 佐藤卓也
  • Organizer: 第67回日本生殖医学会学術講演会・総会
  • Invited
• [Remarks] 雄性生殖細胞の全分化過程の試験管内再構成に成功
  • URL: https://www.yokohama-cu.ac.jp/amedrc/news/202109ogawa_stem.html