Exploration for the amino acid composition in primitive proteins dating back from the last universal common ancestor

Research Project

Project/Area Number	23K20903
Project/Area Number (Other)	21H01200 (2021-2023)
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Multi-year Fund (2024) Single-year Grants (2021-2023)
Section	一般
Review Section	Basic Section 17050:Biogeosciences-related
Research Institution	Waseda University
Principal Investigator	赤沼哲史早稲田大学, 人間科学学術院, 教授 (10321720)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000) Fiscal Year 2024: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000) Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2022: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000) Fiscal Year 2021: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000)
Keywords	生命の起源 / 原始タンパク質 / RNA結合タンパク質 / 触媒 / プレバイオティックアミノ酸
Outline of Research at the Start	「生命の起源」に関する未解決課題の一つに「RNAワールドにどのようにタンパク質が誕生したか？」が挙げられる。アミノ酸生合成経路の誕生以前は、原始環境中に存在したアミノ酸だけから機能を持ったタンパク質が合成されたはずである。本研究では、祖先型再構成したリボソーム蛋白質S8とヌクレオシドニリン酸キナーゼを、それぞれ少数のアミノ酸種類からさらに再構成することによって、RNA結合や酵素活性といった機能を持つタンパク質の誕生に必要な最少アミノ酸種類を明らかにする。次いで、原始地球に多く存在したと推定されているアミノ酸と比較し、原始タンパク質のアミノ酸組成を探る。
Outline of Annual Research Achievements	RNAワールドに誕生した原始タンパク質の少数種類アミノ酸組成の可能性を、タンパク質を少数種類のアミノ酸から再構成することによって検証することが本研究の目的である。本研究期間開始前までに、祖先再構成型リボソーム蛋白質uS8であるP_Bacから系統的かつ網羅的にアミノ酸種類を減らすことによって、15種類のアミノ酸だけから再構成されたアミノ酸組成単純化型改変体P_Bac-15がRNA結合活性を示すことを明らかにした。2021年度には、P_Bac-15からさらにアミノ酸種類を減らした改変体を作製し、そのRNA結合活性を評価した。その結果、14種類のアミノ酸から構成されたP_Bac-14も、P_Bac-15と同様にRNA結合活性を示すことを明らかにした。さらに、P_Bac-14から１種類のアミノ酸を欠損させた13種類のアミノ酸から再構成した改変体をいくつか作製したところ、そのうちの一つがRNA結合活性を持つことも明らかにした。過去の研究で復元した共通祖先型ヌクレオシドニリン酸キナーゼを12種類のアミノ酸で再構成したArc1-12は、ヌクレオシドニリン酸キナーゼ本来の触媒活性を示さないかわりに、別の反応（２分子のADPからATPとAMPを生成する反応）を触媒した。さらに、Arc1-12からリジンを欠損させても、検出可能な酵素活性が保持された。2021年度の研究では、Arc1-12を構成する12アミノ酸のうち、リジン以外のアミノ酸をどれか１種欠損させた11アミノ酸種で構成される改変体をいくつか作製した。これらの改変体の耐熱性と酵素活性を調べたところ、Arc1-12からトレオニンを欠損させたArc1-11Tも、酵素活性を保持することを明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 15種類のアミノ酸だけから祖先型リボソーム蛋白質uS8を再構成したP_Bac-15はヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、トレオニンが欠損しているが、RNA結合活性を示す。P_Bac-15からさらにグルタミンを欠損させたP_Bac-14を作製し、RNA結合活性をプルダウンアッセー法により測定した。その結果、P_Bac-14もRNA結合活性を持つことが明らかとなった。さらに、P_Bac-14からアスパラギン、メチオニン、ロイシンのいずれからのアミノ酸を欠損させた改変体も作成した。これらのうち、P_Bac-14からロイシンを欠損させた改変体は遠紫外円二色スペクトルの結果から２次構造を持たず、天然様構造を形成しないことが示された。一方、P_Bac-14からアスパラギンを欠損した改変体は、RNAと結合することが観察された。すなわち、13種類のアミノ酸からRNA結合活性を持つタンパク質を合成できることが分かった。祖先型ヌクレオシドニリン酸キナーゼを12種類のアミノ酸で再構成したArc1-12は、いくつかの研究から原始環境に比較的豊富に存在したと推定され、しばしばプレバイオティックアミノ酸として参照される10種類のアミノ酸（アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン）に加え、塩基性アミノ酸であるリジンとアルギニンから構成される。Arc1-12からリジン、あるいは、トレオニンを欠損した11種類のアミノ酸から再構成した改変体も触媒活性を保持することも明らかになった。すなわち、主にプレバイオティックアミノ酸で構成される11アミノ酸種類から触媒活性を持つタンパク質が合成できることが示された。これら２つの新しい発見が得られたことから、本研究は概ね順調に進展していると言える。
Strategy for Future Research Activity	2021年度終了時点で、13種類のアミノ酸からリボソーム蛋白質uS8を再構成した改変体であるP_Bac-13NがRNA結合活性を持つことを明らかにした。今後は、S8-13Nからさらにアミノ酸を一種ずつ欠損させた改変体を合成し、RNA結合活性を解析する。同様にして系統的かつ網羅的に欠損させるアミノ酸を１種ずつ増やすことによって、RNA結合能を保持したS8の再構成に必要な最少アミノ酸種類を明らかにする。加えて、BLItz システムを用いて、これまでに作製した少数種類アミノ酸から再構成したuS8とRNAとの結合を定量的評価するための解析も実施する。過去の研究で復元した共通祖先型ヌクレオシドニリン酸キナーゼを12種類のアミノ酸で再構成したArc1-12、Arc1-12からリジンを欠損させたArc1-11KとArc1-12からトレオニンを欠損させたArc1-11Tが、２分子のADPからATPとAMPを生成する反応を触媒することを示した。今後は、Arc1-11KとArc1-11Tからさらにアミノ酸を一種ずつ欠損させた改変体を合成し、酵素活性を解析する。同様にして、系統的かつ網羅的に欠損させるアミノ酸を１種ずつ増やすことによって、酵素活性を保持したタンパク質の再構成に必要な最少アミノ酸種類を明らかにし、少数種アミノ酸がどこまでありえたかを検討する。さらに、ADP以外のヌクレオシドニリン酸、すなわち、GDP、UDP、CDPが基質になるか検討する。反応測定は酵素反応前後の反応液をHPLCで解析することによっておこなう。また、2ADP→ATP＋AMPだけでなく、逆反応であるATP＋AMP→2ADPがArc1-12、Arc1-11K、Arc1-11Tによって触媒されるかも検討する。本研究によって得られた成果は、論文発表および学会発表をおこない、公表する。