Molecular Dynamics of Intracellular Transport of Lipid Nanoparticles: Molecular Mechanism of Nucleic Acid Endosomal Escape
| Project/Area Number |
23K21096
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| Project/Area Number (Other) |
21H01880 (2021-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 32010:Fundamental physical chemistry-related
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
篠田 渉 岡山大学, 異分野基礎科学研究所, 教授 (70357193)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浦野 諒 岡山大学, 異分野基礎科学研究所, 特任助教 (00836976)
宮崎 裕介 岡山大学, 異分野基礎科学研究所, 特任助教 (10963324)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2021: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000)
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| Keywords | 脂質ナノ粒子 / エンドソーム脱出 / 分子シミュレーション / 粗視化 / 膜融合 / 粗視化力場 / 分子動力学シミュレーション / 自由エネルギー解析 |
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| Outline of Research at the Start |
脂質ナノ粒子（LNP）を使った核酸医薬デリバリーは新型コロナウイルスのワクチンにも使用されている。核酸の細胞導入における最大の障壁は核酸のエンドソームからの脱出のステップで、pH変化に伴って核酸を細胞質側に放出するようなLNP設計が試行されており、つまりLNPの主成分の一つであるpH応答性脂質が重要な役割を果たす。しかしLNPの構造やエンドソーム膜との相互作用についての実験情報は乏しい。本課題では分子シミュレーションによってLNPの構造、安定性、核酸のエンドソーム脱出の分子機構を解析し、送達する核酸の種類や分子量に合わせたpH応答性脂質の分子設計、LNP組成を最適化する計算技術の確立を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
脂質ナノ粒子(LNP)はカチオン性脂質を含む複数の脂質分子とコレステロールが核酸分子と作るコンプレックス構造を持つナノ粒子であり、核酸デリバリーのキャリアとして使用されている。カチオン性脂質はpKa~6.4程度に設計され、LNPがエンドサイトーシスによって取り込まれた後、エンドソーム内のpH低下に伴いそのイオン化状態を変える。これによりエンドソーム膜とLNPの相互作用が変化して、核酸分子をエンドソーム外、すなわち細胞質に放出する過程をエンドソーム脱出とよび、この分子機構を分子シミュレーションによって調べる。
これまでに1,2-dilinoleyloxy-3-dimethylaminopropane (MC3)をpH応答性脂質として採用したLNPを構築し分子動力学(MD)計算を行い、その基本構造を解析した。LNPの最外膜は二重層膜構造を持つが完全に閉じた膜ではなく、LNPは球対称構造を持たず異方性を示した。エンドソーム膜をモデリングし、LNPとエンドソーム膜の間の膜融合過程を調べた。pH~5の条件でカチオン性脂質とエンドソーム内のアニオン性脂質が相互作用し、LNPとエンドソーム膜に引力が働くことを確認した。融合中間体であるストーク構造の自発形成には長時間が必要なため、接触面の脱水和を人工的に誘起させてストーク構造を生成し、その後の構造緩和を観測した。12マイクロ秒経過後、融合ポア形成が起こり、LNP内部と細胞質側の水溶液部分がつながった。これによりLNP内部のpHが細胞質と同じ中性となり、pH応答性脂質のイオン化状態を考慮すると、融合プロセスが大きく加速され一気に内包の核酸が細胞質側に放出されることがわかった。一方、このプロセスで細胞質側に放出されない核酸も存在し、また、LNPの最初のエンドソーム膜との接触面に依存して融合ポア生成が起こるレートが大きく異なることも分かってきた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
MC3をpH応答脂質として採用した脂質ナノ粒子(LNP)をモデル系として採用し、そのLNPがエンドソーム膜と膜融合をすることに伴って、LNPに内包された核酸のエンドソーム外への輸送が実現可能であることを、独自に開発したSPICA力場を用いた粗視化分子動力学(MD)シミュレーションによって示した。融合初期の膜融合中間体であるストーク形成後、次の融合ステップである融合ポア形成には長時間(>10マイクロ秒)の構造緩和が必要であった。また、融合ポア形成後の核酸放出プロセスにおいては、ポア形成に伴うLNP内のpH変化が重要な役割を果たすことも明らかとなった。また、LNPは球対称ではないため、最初にエンドソーム膜とストークを形成するLNPの面によって、膜融合の速度は大きく影響を受けることも判明している。これらの検討はエンドソーム膜を平面膜として近似した部分系を用いて行ってきた計算であるが、粗視化力場を用いても130万粒子が必要な系となり、MD計算で扱うには大規模系となっている。
また、他のpH応答性脂質として、SARS-CoV2のmRNAワクチンで実用化されているALC-0315 (Pfizer/BioNTech)、SM-102(Moderna)について、全原子レベルのシミュレーションを行い、粗視化モデリングを実施した。これらの脂質分子をSPICA粗視化力場のライブラリに取り込むことに成功しており、今後、脂質種によるLNPのエンドソーム脱出機構の変化を比較検討するための準備を完了した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの膜融合の検討ではエンドソーム膜を平面膜として近似し、エンドソーム脱出を部分系において観測してきた。しかし、エンドソームには比較的小さなものもあり、それをターゲットとして、エンドソーム全体系のモデリングを実施し、計算を進めて行くことを予定している。エンドソーム全体系を計算する最大のメリットはエンドソーム内外のイオン濃度を個別に設定でき、膜を介するイオン濃度分布を露わに取り込むことができ、そのエンドソーム脱出への影響を観測することができることである。また、膜曲率の影響についても議論が可能となる。この全体系のMD計算には、SPICA粗視化力場を用いても500~600万粒子系を扱う必要が生じ、計算負荷が高くなるため、ストーク形成後、10マイクロ秒ほどの計算が限界となる。しかしながら、イオン濃度分布や膜曲率によっては融合プロセスが加速されると予想され、この時間内でエンドソーム脱出を観測できるものと予想している。
また、他のpH応答性脂質を用いたLNPの生成と平面エンドソーム膜を用いた膜融合プロセスのMD計算も並列して行う予定である。ALC-0315、SM-102のような脂質では、膜の自発曲率がおそらく大きく異なるため、膜融合はさらに加速されるのではないかという予想を持っている。これらを比較検討することによって、エンドソーム脱出機構としての膜融合の速度が脂質やその膜構造とどのように相関するのかを系統的に調べる予定である。
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Report
(2 results)
Research Products
(23 results)
