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Spectroscopy basis for elucidating mechanims of allosteric ligand recognition in GPCR

Research Project

Project/Area Number 23K21097
Project/Area Number (Other) 21H01883 (2021-2023)
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeMulti-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023)
Section一般
Review Section Basic Section 32010:Fundamental physical chemistry-related
Research InstitutionNagoya Institute of Technology

Principal Investigator

片山 耕大  名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00799182)

Project Period (FY) 2021-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2021: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
KeywordsGPCR / アロステリックリガンド / 赤外分光 / 分子振動 / シグナル伝達 / ムスカリン性アセチルコリン受容体 / 赤外分光法
Outline of Research at the Start

本研究では、赤外分光法を創薬の標的分子として重要なGPCRに適用し、リガンド結合に伴う化学的相互作用の変化を分子振動の変化として捉えることで、①アロステリックサイト (結合機構) と②結合に伴う受容体の構造変化 (作用機序) に関する原子レベルの構造情報を取得する。さらに、③リガンドによって活性化したGPCRと結合するシグナル伝達因子 (Gタンパク質/アレスチン) との結合機構を明らかにする。これにより、アロステリックリガンドによるGPCRの活性制御機構の解明に挑む。最終的には①~③を統合し、副作用の少ないアロステリックリガンド開発の根幹をなす、効率的な化合物作りに貢献する。

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、ムスカリン性アセチルコリン受容体 (M2R) に対し、リガンド結合部位を構成するアミノ酸 (Asn404) を標的とした変異体の赤外分光測定を行うことで、リガンド結合時のAsn404の一官能基変化に対応する赤外吸収ピークを帰属することに成功した。さらに、変異体のスペクトル形状が、部分作動薬が結合した際のスペクトル形状に類似することが分かった。また、野生型とのスペクトル比較および分子動力学シミュレーション解析から、変異体ではアセチルコリン (ACh) が安定に受容体内部に結合できないことに加え、受容体内部に結合した水分子由来と考えられる赤外吸収ピークが減少することも分かった。最近報告されたM2RのACh結合型クライオ電顕構造によると、AChが水分子を介してAsn404と水素結合を形成している。以上の結果を踏まえると、変異体では [Gln404-水分子-ACh] 水素結合系が正しく形成されないことで受容体が十分に活性化できず、部分作動性を生み出すと考えられ、Asn404がM2R活性化のホットスポット残基であることを強く示すことができた。これらの研究成果は現在論文にまとめており、今年中の論文発表を目指す。
一方で、昨年度から継続して行う、光応答性GPCR、ロドプシンと抗体との結合誘起赤外分光研究について、抗体の選択的なロドプシンへの結合によって、ロドプシン中間体の動的な構造変化情報を獲得することに成功し、これらの成果をNature Communications誌に共責任著者として発表した。また、これにより、 “タンパク質―タンパク質”相互作用解析が可能になったことで、現在、光応答性GPCRの一つである、非視覚型オプシンとGタンパク質、M2RとGタンパク質との相互作用に伴う分光解析を進めており、予備実験によって、構造変化由来の赤外吸収ピークの抽出にも成功している。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本研究では、M2Rを研究対象として、赤外分光法を中心とした構造解析を行い、物理化学的な観点からGPCRのアロステリックリガンド結合機構、作用機序、そしてアロステリックリガンドによって制御されるGタンパク質やアレスチンを介したGPCRのシグナル伝達機構を明らかにすることを目指している。2023年度は、M2Rの変異体に対する測定、さらに天然リガンドアセチルコリンの誘導体を数種類作成し測定することで、リガンド結合および活性化に重要なAsn404およびタンパク質結合水の赤外信号を帰属することに成功した。さらに、MDシミュレーション解析と組み合わせることで、アセチルコリンの結合がどのようなメカニズムでM2Rの活性化を引き起こすのか、その分子機構の一端を明らかにすることができた。今回明らかにした活性化メカニズムは、アロステリックな活性化機構の理解を深めるだけでなく、タンパク質に特異的に結合した水分子が積極的にGPCRの活性化機構に関与していることを実験的に強く示しており、今後、薬剤設計に水分子の寄与までを考慮することを提示する研究成果である。

Strategy for Future Research Activity

従来より、ムスカリン性アセチルコリン受容体を標的にした薬剤設計は、M1R-M5Rの5つのサブタイプ間でのアミノ酸相同性が高いことから、副作用の問題を克服することが困難とされてきた。しかしながら、本研究によって、リガンドと受容体、そして水分子によって形成される緻密な水素結合ネットワークが活性化に寄与していることが分かり、必ずしもアミノ酸の一次配列の相同性から活性化メカニズムが類似しないことを示唆した。従って、今後、M2Rに留まらず、全てのサブタイプに対する赤外分光測定を通して、詳細なリガンド結合に伴う活性化機構を明らかにすることで、副作用を軽減することを可能にするサブタイプ選択的な薬剤設計が可能になると考えている。また、その一方で、本研究によりアロステリックリガンドのうちNAMに対する作用機序が明らかになりつつあることから、PAMについても同様のスペクトル解析を通じて、結合機構や活性制御機構の解明を目指す。

Report

(3 results)
  • 2023 Annual Research Report
  • 2022 Annual Research Report
  • 2021 Annual Research Report
  • Research Products

    (65 results)

All 2024 2023 2022 2021 Other

All Int'l Joint Research (5 results) Journal Article (10 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Peer Reviewed: 10 results,  Open Access: 8 results) Presentation (48 results) (of which Int'l Joint Research: 20 results,  Invited: 8 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

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    • DOI

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      Volume: 4 Issue: 1 Pages: 1-10

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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 全反射赤外分光法によるアセチルコリン受容体のアロステリック機構の解析2022

    • Author(s)
      杉浦勇也、片山耕大、寿野良二、神取秀樹
    • Organizer
      第62生物物理若手の会 夏の学校
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  • [Presentation] 全反射赤外分光法によるkappa-オピオイド受容体のリガンド認識機構研究2022

    • Author(s)
      岩田聖矢、片山耕大、魲洸平、辻本浩一、寿野千代、寿野良二、岩田想、小林拓也、神取秀樹
    • Organizer
      第62生物物理若手の会 夏の学校
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  • [Presentation] TATロドプシンへのカルシウム結合2022

    • Author(s)
      杉本哲平、片山耕大、神取秀樹
    • Organizer
      第62生物物理若手の会 夏の学校
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  • [Presentation] TATロドプシンへのカルシウム結合2022

    • Author(s)
      杉本哲平、片山耕大、神取秀樹
    • Organizer
      第16回分子科学討論会
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  • [Presentation] 振動分光法により読み解くGPCRリガンド認識・シグナリングの正確性かつ自由性2022

    • Author(s)
      片山耕大、魲洸平、寿野良二、神取秀樹
    • Organizer
      第16回分子科学討論会
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      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] Vibrational spectroscopic study of Allosteric Mechanism on human muscarinic acetylcholine receptor2022

    • Author(s)
      Y. Sugiura, K. Katayama, R. Suno, H. Kandori
    • Organizer
      The 60th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Spectroscopic analysis of novel microbial rhodopsin showing photoreaction from all-trans- to 11-cis-retinal2022

    • Author(s)
      M. Aoyama, K. Katayama, R. Abe-Yoshizumi, M. Sugiura, A. Rozenberg, I. Kaczmarczyk, D. Matzov, T. Nagata, M. Shalev-Benami, O. Beja, K. Inoue, Y. Furutani, H. Kandori
    • Organizer
      The 60th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] ATR-FTIR study of ligand recognition on GPCRs2022

    • Author(s)
      S. Iwata, K. Katayama, K. Suzuki, R. Suno, C. Suno, H. Tsujimoto, T. Kobayashi, S. Iwata, H. Kandori
    • Organizer
      The 60th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Spectroscopic study of TAT rhodopsin bound with calcium ion2022

    • Author(s)
      T. Sugimoto, K. Katayama, H. Kandori
    • Organizer
      The 60th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] An investigation into the allosteric mechanism of human acetylcholine receptor utilizing infrared spectroscopy2022

    • Author(s)
      Y. Sugiura, K. Katayama, R. Suno, H. Kandori
    • Organizer
      19th International Conference on Retinal Proteins
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] ATR-FTIR study of hydrophilic and hydrophobic ligands recognition on kappa-opioid receptor2022

    • Author(s)
      S. Iwata, K. Katayama, K. Suzuki, R. Suno, C. Suno, H. Tsujimoto, T. Kobayashi, S. Iwata, H. Kandori
    • Organizer
      19th International Conference on Retinal Proteins
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Spectroscopic study of TAT rhodopsin bound with calcium ion2022

    • Author(s)
      T. Sugimoto, K. Katayama, H. Kandori
    • Organizer
      19th International Conference on Retinal Proteins
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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 振動分光法を基軸としたGPCRアロステリックリガンド作用機構解析2022

    • Author(s)
      片山耕大
    • Organizer
      令和4年度新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム・領域会議
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  • [Presentation] Vibrational spectroscopic study of G protein-coupled receptor2022

    • Author(s)
      K. Katayama
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      Molecular Movies International Symposium 2022
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Structural biological study based on spectroscopic analysis of cone pigment2021

    • Author(s)
      K. Katayama
    • Organizer
      第15回分子科学討論会2021
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    • Invited
  • [Presentation] 振動分光法から理解するGPCRのリガンド認識・活性化機構2021

    • Author(s)
      片山耕大
    • Organizer
      第13回高速分子動画オンラインセミナー
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      2021 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] X-tallization trial of primate green opsin for understanding spectral tuning mechanism2021

    • Author(s)
      片山耕大、大橋沙也佳、N. Nuemket、南後恵理子、神取秀樹
    • Organizer
      令和三年度 新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム
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      2021 Annual Research Report
  • [Presentation] Conformational dynamics upon ligand binding in muscarinic acetylcholine receptor revealed by FTIR spectroscopy2021

    • Author(s)
      K. Katayama
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      第59回日本生物物理学会年会
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      2021 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Spectroscopic basis for elucidating spectral tuning mechanism of cone pigments2021

    • Author(s)
      K. Katayama
    • Organizer
      Pacifichem2021
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    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Book] 量子生命科学ハンドブック2024

    • Author(s)
      片山耕大
    • Total Pages
      372
    • Publisher
      (株)エヌ・ティー・エス
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  • [Remarks] ヒトはホルモンや神経伝達物質をどうやって受け取っているのか?

    • URL

      https://katayama-lab.web-ac.jp/

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Published: 2021-04-28   Modified: 2024-12-25  

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