オルガネラ代謝物の化学標識による時空間メタボローム解析

• Project/Area Number: 23K21151
• Project/Area Number (Other): 21H02058 (2021-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2021-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 37010:Bio-related chemistry
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 田村 朋則 京都大学, 工学研究科, 講師 (10746639)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000); Fiscal Year 2024: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2022: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2021: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
• Keywords: 脂質 / イメージング / リピドミクス / CRISPRスクリーニング / ホスファチジルコリン / O-Click FC / フローサイトメトリー / オルガネラ / メタボロミクス / 代謝物

Outline of Research at the Start

メタボローム（代謝物総体）は表現型と直接相関する重要な生体分子群であり、生命現象の理解のためにはメタボロームの時空間的な発現プロファイル解析が不可欠である。しかし、その生化学的・分析化学的な扱いにくさから、細胞内代謝物を高い時空間分解能で調べる方法はほとんどない。このような背景から、本研究では時空間メタボロミクスを実現する新手法の開発を目指す。具体的には、細胞内の狙ったオルガネラ内に存在する代謝物を任意のタイミングで空間特異的に化学標識するための反応性分子プローブを開発し、これを用いた新規メタボロミクス法を確立する。

Outline of Annual Research Achievements

従来型の細胞の脂質分析では、大量に集めた細胞抽出物の放射線分析や質量分析を行う方法が主流である。この方法には多大な時間と労力がかかり、多数のサンプルを解析する際のボトルネックとなっている。２万種類にもおよぶ人の遺伝子と脂質代謝の関わりを突き止めるためには、本課題の解決が重要である。本研究では、細胞オルガネラ特異的に脂質を蛍光標識する我々独自の技術を活用し、細胞内における脂質の「存在量」と「空間分布」を、単純な蛍光シグナル情報として捉えて超高速（1万細胞/1秒）に解析する技術「O-ClickFC」を開発した。本技術の活用により、人の全遺伝子の変異をもつ細胞集団から、脂質の代謝が異常な細胞を選別し、その原因遺伝子を同定することが可能となった。我々は実証実験として、人の脂質の主要成分であるホスファチジルコリンの代謝に重要な遺伝子49個を同定し、FLVCR1など多数の新規遺伝子を発見した。詳細な解析から、FLVCR1は生命維持に必須の栄養素コリンを細胞内に取り込ませる役割をもつことを見出した。さらに、遺伝性神経疾患の原因となる変異型FLVCR1はコリン取り込み活性を喪失するという病態発現メカニズムの一端を解明した。
本技術は、今後、脂質だけでなく、糖やアミノ酸などの様々な代謝物の解析に応用できいると予想され、がん・肥満・糖尿病など代謝異常が原因である生活習慣病の病態解明に貢献すると考えられる。また、病態発現と代謝異常を結びつけている遺伝的要因や、創薬標的の候補分子を網羅的に同定することで、さまざまな疾患における治療法の開発が期待される。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初の予想を大きく上回る成果として、オルガネラ選択的脂質ラベリング技術を応用してホスファチジルコリンの関連遺伝子を網羅的にスクリーニングする新手法O-Click FCの開発に成功した。

Strategy for Future Research Activity

今後はO-Click FCの適用範囲を拡張を目指し、他の様々な脂質種や脂肪酸特異的な蛍光標識技術を開発する。また、得られた遺伝子リストの中からホスファチジルコリンとの関連性が未だ解明されていない遺伝子を複数ピックアップし、そのフォローアップ検証を実施する。

Research Products

• [Journal Article] Organelle-selective click labeling coupled with flow cytometry allows pooled CRISPR screening of genes involved in phosphatidylcholine metabolism (2023)
  • Author(s): Masaki Tsuchiya, Nobuhiko Tachibana, Kohjiro Nagao, Tomonori Tamura, Itaru Hamachi
  • Journal Title: Cell Metabolism Volume: - Issue: 6 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1016/j.cmet.2023.02.014
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Revisiting PFA-mediated tissue fixation chemistry: FixEL enables trapping of small molecules in the brain to visualize their distribution changes (2023)
  • Author(s): Nonaka Hiroshi、Mino Takeharu、Sakamoto Seiji、Oh Jae Hoon、Watanabe Yu、Ishikawa Mamoru、Tsushima Akihiro、Amaike Kazuma、Kiyonaka Shigeki、Tamura Tomonori、Radu Aricescu A.、Kakegawa Wataru、Miura Eriko、Yuzaki Michisuke、Hamachi Itaru
  • Journal Title: Chem Volume: 9 Issue: 2 Pages: 523-540
  • DOI: 10.1016/j.chempr.2022.11.005
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Endogenous Cell-Surface Receptor Modification by Metal Chelation-Assisted Pyridinium Oxime Catalyst (2023)
  • Author(s): Thimaradka Vikram、Utsunomiya Hayata、Tamura Tomonori、Hamachi Itaru
  • Journal Title: Organic Letters Volume: 25 Issue: 12 Pages: 2118-2122
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.3c00541
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Lysine-Reactive <i>N</i>-Acyl-<i>N</i>-aryl Sulfonamide Warheads: Improved Reaction Properties and Application in the Covalent Inhibition of an Ibrutinib-Resistant BTK Mutant (2023)
  • Author(s): Kawano Masaharu、Murakawa Syunsuke、Higashiguchi Kenji、Matsuda Kenji、Tamura Tomonori、Hamachi Itaru
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 145 Issue: 48 Pages: 26202-26212
  • DOI: 10.1021/jacs.3c08740
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Light-induced stabilization of microtubules by photo-crosslinking of a Tau-derived peptide (2022)
  • Author(s): Watari Soei、Inaba Hiroshi、Tamura Tomonori、Kabir Arif Md. Rashedul、Kakugo Akira、Sada Kazuki、Hamachi Itaru、Matsuura Kazunori
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 58 Issue: 66 Pages: 9190-9193
  • DOI: 10.1039/d2cc01890j
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Chemical biology tools for imaging-based analysis of organelle membranes and lipids (2022)
  • Author(s): Tamura Tomonori、Hamachi Itaru
  • Journal Title: Current Opinion in Chemical Biology Volume: 70 Pages: 102182-102182
  • DOI: 10.1016/j.cbpa.2022.102182
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Covalent inhibitors targeting amino acid residues other than cysteine (2022)
  • Author(s): Tamura Tomonori
  • Journal Title: Folia Pharmacologica Japonica Volume: 157 Issue: 5 Pages: 383-383
  • DOI: 10.1254/fpj.22031
  • ISSN: 0015-5691, 1347-8397
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Organelle-selective labeling of choline-containing phospholipids(CPLs) and real-time imaging in living cells (2021)
  • Author(s): Masaki Tsuchiya, Tomonori Tamura, Itaru Hamachi
  • Journal Title: Current Protocols Volume: 1 Issue: 4
  • DOI: 10.1002/cpz1.105
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] オルガネラ膜特異的なホスファチジルコリンのライブイメージング (2021)
  • Author(s): 田村朋則、浜地格
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 39 Pages: 594-600
• [Presentation] オルガネラ選択的脂質ラベリングと遺伝子スクリーニング (2023)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] A nongenetic, optochemical method for proximity labeling in the live mouse brain (2023)
  • Author(s): Mikiko Takato, Seiji Sakamoto, Hiroshi Nonaka, Tomonori Tamura, Itaru Hamachi
  • Organizer: EMBL Wellcome Connecting Science Conference Proteomics in cell biology and disease mechanisms
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] オルガネラ選択的脂質ラベリング (2023)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: 東京大学工学系研究科 化学生命工学専攻 講演会
  • Invited
• [Presentation] ヘムトランスポーター FLVCR1 の未知機能の発見 (2023)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: メタルバイオサイエンス研究会2023
  • Invited
• [Presentation] オルガネラ選択的脂質ラベリングを利用した脂質代謝因子のCRISPRスクリーニング (2023)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: 第17回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] 脂肪酸代謝物のオルガネラ選択的ラベリング (2023)
  • Author(s): 木村 天海、土谷 正樹、田村 朋則、浜地 格
  • Organizer: 第17回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] Conditional Proteomics Approaches to Identify Proteins Related to Biometals and Signaling Molecules (2022)
  • Author(s): Tomonori Tamura
  • Organizer: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Cnference
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 蛋白質/脂質の in situ ケミカルラベリング (2022)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: 第39回メディシナルケミストリーシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] オルガネラ選択的タンパク質・脂質ラベリング (2022)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: 第95回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] コンディショナルプロテオミクスによる金属関連タンパク質のイメージングとプロファイリング (2022)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会
  • Invited
• [Presentation] 金属イオン応答性タンパク質修飾プローブを用いたコンディショナルプロテオミクス (2022)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: 第33回日本微量元素学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] オルガネラ選択的脂質ラベリングによる脂質制御因子の遺伝子スクリーニング (2022)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: 第22回日本蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] オルガネラ選択的脂質ラベリングの新展開（３）：ホスファチジルイノシトールへの拡張 (2022)
  • Author(s): 木村 天海、田村 朋則、浜地 格
  • Organizer: 日本化学会 第102春季年会
• [Presentation] Development of novel proteomics methods based on biocompatible organic chemistry (2022)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: 第 5 回 京都生体質量分析研究会国際シンポジウム
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] タンパク質/脂質の in situ 化学修飾 (2021)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: 東京大学 化学生命工学専攻 2021 年度 談話会
  • Invited
• [Presentation] Organelle-selective labeling and imaging of choline-containing phospholipids (2021)
  • Author(s): 田村朋則
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research