窒素固定菌の新規な炭素源獲得戦略としての異種微生物間共生型窒素固定の解明

Research Project

Project/Area Number	23K21170
Project/Area Number (Other)	21H02108 (2021-2023)
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Multi-year Fund (2024) Single-year Grants (2021-2023)
Section	一般
Review Section	Basic Section 38020:Applied microbiology-related
Research Institution	Kagoshima University
Principal Investigator	境雅夫鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 教授 (20225775)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山田直隆九州大学, 農学研究院, 助教 (20304769) 池永誠鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (70511822)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥16,380,000 (Direct Cost: ¥12,600,000、Indirect Cost: ¥3,780,000) Fiscal Year 2024: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000) Fiscal Year 2023: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000) Fiscal Year 2022: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000) Fiscal Year 2021: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Keywords	窒素固定 / 植物体分解 / 微生物生態 / セルロース分解
Outline of Research at the Start	本研究では「窒素固定菌の新規な炭素源獲得戦略としての異種微生物間共生型窒素固定システムの解明と利用」に関する研究を目的とする。これまで、土壌生態系における窒素固定菌は、大きく2つの生態型が推定されてきた。①土壌中で自由生活をする単生型の窒素固定菌、②植物との共生生活（緩やかな共生を含む）をする共生型の窒素固定菌、の2つの生態型である。この従来の生態型に加えて、窒素固定菌の炭素源獲得戦略の違いに基づき、新たに③セルロースを分解する嫌気性細菌と共生的に生活する「異種微生物間共生型の窒素固定菌」による新規な窒素固定システムの存在を明らかにし、その構造・機能・生態を解明する。
Outline of Annual Research Achievements	これまでの研究において、「異種微生物間共生型窒素固定菌集団」は土壌生態系において広く分布する可能性が示唆された。また、多様な細菌種で構成されており、採取地点ごとに細菌種構成や活性が異なることを明らかにした。そこで、これらの異種微生物間共生型窒素固定菌集団内における物質代謝を調査するため、メタボローム解析を実施した。培養液中の代謝物を網羅的に解析するために、キャピラリー電気泳動－質量分析計（CE-MS）による分析を行った。その結果、Lactic acid、Propionic acid、Butyric acid、Valeric acidのような短鎖脂肪酸が検出され、セルロースが分解・発酵により代謝されることが示唆された。しかし、これらの短鎖脂肪酸の存在量は微量であるため、経時的な変化などを正確に調査することができなかった。その原因として用いた集団の代謝活性が低いことが考えられたため、より活性の高い異種微生物間共生型窒素固定菌集団を構築することにした。最終的に構成細菌種の組合せを変化させることにより、高い活性の集団3系統を得ることができた。元の集団は基質セルロースをほぼ分解するのに21～28日を必要としたが、高活性の集団は14～21日で分解が完了した。また、培養の安定性も向上しており、元の集団は継代培養に培地の1/50以上の接種量が必要であったが、得られた高活性の集団は培地の1/500の接種量で安定して継代培養することが可能となった。高活性集団３系統の細菌群集構造を16S rRNA遺伝子の分子系統解析（メタ16S解析）により調べた結果、元の集団と比べ難培養性で知られるVerrucomicrobia門の細菌の相対存在比が大きいことが共通した特徴であった。このことから、構成細菌種の組合せを変化させることにより、活性や集団の安定性の異なる培養系を構築できることが示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 予定の培養系の探索に加え、より活性の高いコンソーシアム培養系の獲得とその特性の解析が実施できた。
Strategy for Future Research Activity	集団内の構成細菌種が異種微生物間共生型窒素固定菌集団システムにおいてどのような機能・役割を持つのか、培養困難な細菌種のゲノム解析も実施して明らかにする。