| Project/Area Number |
23K21172
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| Project/Area Number (Other) |
21H02113 (2021-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
栗田 大輔 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (60552651)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
葛西 秋宅 弘前大学, 医学研究科, 助教 (20609664)
行木 信一 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (80302959)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
Fiscal Year 2021: ¥9,230,000 (Direct Cost: ¥7,100,000、Indirect Cost: ¥2,130,000)
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| Keywords | リボソーム / YaeJ / 翻訳 / タンパク合成 |
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| Outline of Research at the Start |
YaeJによる翻訳停滞解消システムの分子メカニズムを解明し、他のリボソームレスキューシステムとの使い分けを明らかにするために、YaeJ/リボソーム複合体の生理学的解析・生化学的解析・構造生物学的解析を行い、in vivoおよびin vitroの両面からYaeJの役割を明らかにしていく。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、YaeJによるリボソームレスキュー機構の分子メカニズムを明らかにするために、YaeJ/リボソーム複合体に対して、機能解析および構造解析を行うものである。令和5年度は部位特異的ラジカルプロービングおよびクライオ電子顕微鏡による立体構造解析を中心に進めた。昨年度まではYaeJのC末端に集中的にシステインを導入した変異体を作製してきたが、今年度はN末端（ペプチジルtRNA加水分解の活性中心付近）の変異体を多数作製した。YaeJのC末端に変異を導入するとリボソームへの結合活性が低下するものが多く見られたが、N末端の変異体では、そのような変異体はほとんど見られなかった。この変異体を用いてラジカルプロービングを行った。C末端の変異体と異なり、rRNAの切断を示すものは少なかったが、一部で23S rRNAを切断するものが得られた。YaeJのC末端変異体はすべて16S rRNAを切断するものしか得られなかったが、今回得られた変異体は、リボソーム中でのYaeJのN末端ドメインの位置情報を与えるものであり、興味深いものである。
次に、クライオ電子顕微鏡による立体構造解析を行った。現在、複合体の解析を進めており画像解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ラジカルプロービング解析について、これまで使用していた蛍光DNAシークエンサーが経年劣化により使用不可能になった。代わりの装置を使用して続けているが、使用する蛍光試薬が異なるため、全てのデータを取り直す必要に迫られた。幸い、タンパク質およびリボソームのサンプルは十分な量を調製していたため、大きな遅れとはならずに済んでいる。クライオ電子顕微鏡解析に着手し、順調にデータを得ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ラジカルプロービング解析は、引き続きYaeJのシステイン変異体を増やして複合体の構造解析を進めていく。作製した変異体の中に興味深い活性を示すものを得たため、バイオレイヤー干渉法およびin vitro翻訳系によるペプチジルtRNA加水分解活性によって、変異が活性に与える影響を明らかにする予定である。また、クライオ電子顕微鏡による立体構造解析については、画像解析に時間を要するため引き続き進めていく。
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