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Development of precise genome editing technology without genetic transformation or tissue culture in conifer species.

Research Project

Project/Area Number 23K21216
Project/Area Number (Other) 21H02242 (2021-2023)
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeMulti-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023)
Section一般
Review Section Basic Section 40010:Forest science-related
Research InstitutionForest Research and Management Organization

Principal Investigator

七里 吉彦  国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 等 (80461292)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 岩崎 崇  鳥取大学, 農学部, 准教授 (30585584)
小長谷 賢一  国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 等 (30582762)
遠藤 圭太  国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 林木育種センター, 主任研究員 等 (00754368)
Project Period (FY) 2021-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help
¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2021: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Keywordsゲノム編集 / スギ / 直接導入 / 樹木 / in planta
Outline of Research at the Start

ゲノムDNAの狙った領域を改変する「ゲノム編集」は、ピンポイントで形質を改変させ育種期間を短縮する新技術として、林木育種への利用が期待されている。しかし、植物でのゲノム編集には遺伝子組換えが必要なため、林木でのゲノム編集の汎用性・実用性は低い。なぜなら、1)遺伝子組換えは一部の林木でしか確立しておらず、2)ゲノムDNAに導入したゲノム編集遺伝子は交配で除去する必要があり、林木では長期間を要するからである。本研究は、ゲノム編集タンパク質を茎頂分裂組織に直接導入することで、遺伝子組換えが不要で、1年以内にゲノム編集林木個体を獲得できる「in planta直接ゲノム編集法」の開発を目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

本課題の遂行のため、本年度は(1)茎頂分裂組織へのゲノム編集タンパク質導入条件の最適化、(2)ゲノム編集効率を向上させる界面活性剤の使用条件の最適化、そして直接導入系のブラッシュアップのためのGFP復活系の構築を行った。さらに、(3)カラマツ培養細胞におけるゲノム編集条件の検討について実施した。

(1)、(2) 茎頂組織へのタンパク質導入効率を向上させる目的で、スギ芽生えの乾燥処理を試みた。以前スギ不定胚で試みた際は、24時間の乾燥処理で色水吸収性が大幅にアップしたが、芽生えでは組織から水分が速やかに失われてしまい、生存率が大幅に減少する結果となった。また、RNPバッファーに界面活性剤とCo, Cu, Ni等の金属イオンを添加することで、取り込み効率が1.5倍程度向上した。
[GFP復活系の構築]
細胞でのゲノム編集効率を算出するために、次世代シーケンサーによる網羅的な塩基解析が用いられている。しかし、この方法はDNA抽出という破壊的な工程を伴うため、経時的な経過観察が不可能である。そこで、非破壊的かつ経時的なゲノム編集効率の見積もりのため、変異を加えた緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子(以下GFPm)をあらかじめスギに導入し、ゲノム編集によりこれを改変することでGFP蛍光が回復する、という「GFP復活系」を構築した。この系がスギ細胞で機能するか検証するため、GFPm導入スギ細胞系統を作出し、それらにGFP蛍光回復のためのゲノム編集ベクターを導入した。その結果、期待通り細胞でのGFP蛍光の回復が見られた。
(3)カラマツにおいてマグネシウムキラターゼ遺伝子を単離し、標的領域を2つ選定した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度に計画した各小課題について、それぞれが計画どおりに進展していることから、「おおむね順調に進展している」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

昨年度に、変異を加えた緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子(以下、GFPm)をあらかじめスギ細胞に導入し、ゲノム編集によりこれを改変することでGFP蛍光が回復する、という「GFP復活系」を構築した。これにより、非破壊的かつ経時的にゲノム編集効率を見積もることが可能となった。今年度はこのGFP復活系を用いて、以下の研究計画を行う予定である。

【1. 茎頂分裂組織へのゲノム編集タンパク質導入条件の最適化】 GFPmを導入したスギ細胞から不定胚を誘導し、不定胚の茎頂を標的にGFP蛍光を復活させるゲノム編集をCPP直接導入で試みる。
【2. GFF復活系を用いたゲノム編集効率を向上させる界面活性剤の迅速スクリーニング】 これまでもスギの細胞を用いた直接導入試験において、ゲノム編集効率を向上させる界面活性剤の探索を行ってきたが、実験の再現性や結果が出るまでの煩雑さから、まだ決定版の界面活性剤は見いだせていない。今回GFP復活系を用いて、迅速にゲノム編集効率を向上させる界面活性剤を選定する。
【3. 薬剤耐性タンパク質とゲノム編集タンパク質の共導入系の構築】 直接導入された細胞の選抜を試みるため、ゲノム編集タンパク質と同時に薬剤耐性タンパク質、具体的にはスギの遺伝子組換え細胞の選抜に用いられているNPTIIタンパク質を用いて、抗生物質耐性を一時的に付与された細胞が単離できるか条件検討を行う。

Report

(3 results)
  • 2023 Annual Research Report
  • 2022 Annual Research Report
  • 2021 Annual Research Report
  • Research Products

    (13 results)

All 2023 2022 2021

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (8 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 2 results) Book (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results) (of which Overseas: 1 results)

  • [Journal Article] バイオテクノロジーを活用した林木育種の可能性2022

    • Author(s)
      小長谷賢一
    • Journal Title

      森林科学

      Volume: 96 Pages: 12-15

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
  • [Journal Article] Direct protein delivery into intact plant cells using polyhistidine peptides2021

    • Author(s)
      Tanaka Yoshino、Nanasato Yoshihiko、Omura Kousei、Endoh Keita、Kawano Tsuyoshi、Iwasaki Takashi
    • Journal Title

      Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

      Volume: 85 Issue: 6 Pages: 1405-1414

    • DOI

      10.1093/bbb/zbab055

    • Related Report
      2021 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Japanese cedar (Cryptomeria japonica D. Don)2021

    • Author(s)
      Nanasato Yoshihiko、Mikami Masafumi、Futamura Norihiro、Endo Masaki、Nishiguchi Mitsuru、Ohmiya Yasunori、Konagaya Ken-ichi、Taniguchi Toru
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 11 Issue: 1 Pages: 16186-16186

    • DOI

      10.1038/s41598-021-95547-w

    • Related Report
      2021 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Development of a Genome Editing System in Japanese cedar (Cryptomeria japonica D. Don) using the CRISPR/Cas9 System(CRISPR/Cas9を利用したスギのゲノム編集システムの構築)2023

    • Author(s)
      七里吉彦、佐藤良介、上野真義、田中淑乃、 大村昂誠、遠藤圭太、遠藤真咲、岩崎崇、髙田直樹、小長谷賢一、谷口亨
    • Organizer
      第15回国際植物バイオテクノロジー学会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] カラマツおける植物体再生系と培養細胞の凍結保存法の確立2022

    • Author(s)
      小長谷賢一、三嶋賢太郎、井城泰一、福田陽子、谷口亨
    • Organizer
      日本植物バイオテクノロジー学会(堺)大会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] Discovery and applied studies of polyhistidine peptides.2022

    • Author(s)
      T. Iwasaki
    • Organizer
      第59回ペプチド討論会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 細胞膜透過ペプチドを利用した遺伝子組換えに依存しない植物ゲノム編集技術2022

    • Author(s)
      田中淑乃、七里吉彦、大村昂誠、河野 強、遠藤圭太、岩﨑 崇
    • Organizer
      日本農芸化学会2022年度大会
    • Related Report
      2021 Annual Research Report
  • [Presentation] スギのゲノム編集技術が切り開く森林の未来2022

    • Author(s)
      七里吉彦
    • Organizer
      大阪都市再生部会第4回研究会
    • Related Report
      2021 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] A Non-Transgenic Plant Genome Editing Method Using Cell-Penetrating Peptides Polyhistidine Peptides.2021

    • Author(s)
      Y. Tanaka, Y. Nanasato, K. Omura, K. Endoh, T. Kawano and T. Iwasaki
    • Organizer
      第58回ペプチド討論会
    • Related Report
      2021 Annual Research Report
  • [Presentation] ゲノム編集を志向した植物細胞への酵素直接導入法の開発2021

    • Author(s)
      田中淑乃、七里吉彦、大村昂誠、河野 強、遠藤圭太、岩﨑 崇
    • Organizer
      日本ゲノム編集学会第6回大会
    • Related Report
      2021 Annual Research Report
  • [Presentation] 塩基編集技術による除草剤耐性スギ(Cryptomeria japonica D. Don)細胞系統の作出2021

    • Author(s)
      七里吉彦、小長谷賢一、上野真義、遠藤真咲、谷口亨
    • Organizer
      第38回日本植物バイオテクノロジー学会
    • Related Report
      2021 Annual Research Report
  • [Book] ひとりではじめる植物バイオテクノロジー入門 組織培養からゲノム編集まで2022

    • Author(s)
      田部井豊、七里吉彦、三柴啓一郎、安本周平
    • Total Pages
      413
    • Publisher
      国際文献社
    • ISBN
      9784910603032
    • Related Report
      2022 Annual Research Report 2021 Annual Research Report
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 細胞膜透過ペプチドを利用した遺伝子組換えに頼らない植物ゲノム編集技術2021

    • Inventor(s)
      岩﨑崇、大村昂誠、田中淑乃、七里吉彦
    • Industrial Property Rights Holder
      鳥取大学、森林研究・整備機構
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Filing Date
      2021
    • Related Report
      2021 Annual Research Report
    • Overseas

URL: 

Published: 2021-04-28   Modified: 2024-12-25  

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