| Project/Area Number |
23K21267
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| Project/Area Number (Other) |
21H02354 (2021-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
落合 謙爾 岩手大学, 農学部, 教授 (80214162)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福田 智一 岩手大学, 理工学部, 教授 (40321640)
畑井 仁 岩手大学, 農学部, 特任教授 (40566535)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
Fiscal Year 2021: ¥7,930,000 (Direct Cost: ¥6,100,000、Indirect Cost: ¥1,830,000)
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| Keywords | 鳥白血病ウイルス / グリオーマ / 発癌 / 分子クローン / 共感染 / 鶏 / 神経膠腫 / プロウイルス / 無限分裂細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
鳥白血病ウイルス（ALV）により誘発される鶏のグリオーマの発生時期，発生頻度をみると，この特性は既知のALV発癌の分子機構，プロウイルス挿入変異では説明できない。異なる分子機構が存在すると推察される。本課題はこれを仮設として１）感染細胞率とグリオーマ発生率との関連，2）ALV株間のグリオーマ誘発能の厳密な比較，３）グリオーマ由来培養細胞の作製，４）このグリオーマ由来培養細胞の分子生物学的解析を通して，レトロウイルスの多様な病原性の分子基盤を解明することを目指している。
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| Outline of Annual Research Achievements |
鶏のグリオーマは星状膠細胞が多発性かつ結節性に増殖する鶏の疾患で，原因は鳥白血病ウイルスA亜群（ALV-A）の一株，鶏の神経膠腫誘発ウイルス（FGVp）とその変異体である。FGV変異株は心臓病原性を示すFGVp_クラスターと，心臓病原性を欠くKm_クラスターとの2つに分かれて拡散している。本課題はFGVの解析を通してレトロウイルスの多様な病原性の分子基盤を解明することを目的としており，第3年度に得られた成績は以下の通りである。(1)各クラスターを特異的に検出可能なリアルタイム PCR法を用いて野外で飼育されていた肥後ちゃぼ13羽のFGV感染状況を解析した。13例中10例で共感染が確認され，ALVの共感染が常在化していることがあらためて浮き彫りとなった。(2) 共感染鶏1羽から2つの感染性分子クローン，KmN_77_Clone_AおよびKmN_77_Clone_Bを分離した。KmN_77_Clone_AはFGVp_クラスターに属し，Clone_BはKm_クラスターに分類された。(3) これら2つの分子クローンを DF-1細胞に感染させて，in vitroで共感染の再現を試みた。DF-1細胞に2つの分子クローンを接種すると，接種の順番にかかわらず，培養細胞で共感染が成立することがわかった。(4) 次に2つの分子クローンを単独で鶏有精卵に接種することにより，各クローンの中枢神経系と心臓に対する病原性を解析した。その結果，2つの分子クローンはそれぞれが単独でグリオーマと心筋異常の両者を誘発した。この成績からKm_クラスターに属するFGV変異株は心臓病原性をまったく失っているわけではなく，弱いながらも持っていることが示唆された。しかし，この実験では脳と心臓に形成された病変の程度，頻度と感染細胞率との相関性の有無を明らかにできなかったことから，これらの検証が今後の課題として残された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題は 1) FGVのプロウイルス量とグリオーマの発生率との関連，2) ALV株間のグリオーマ誘発能の厳密な比較，3) グリオーマ由来培養細胞の作製と4) その分子生物学的解析からなり，これら4つの解析からレトロウイルスの多様な病原性の分子基盤を解明することを目的とする。前述のとおり，FGV変異株は国内でFGVp_クラスターとKm_クラスターの2つに分かれて拡散している。一方，同じA亜群に分類されるFGV変異株同士は干渉現象により同じ個体には共感染しないというのがこれまでの常識であった。しかし，本研究により肥後ちゃぼではFGV変異株の共感染が頻繁に起こっていること，感染鶏1羽から2つの感染性分子クローンが分離され，これら分子クローンは異なるクラスターに分類されたこと，これら2つの分子クローンを用いてALVの共感染をin vitroで再現できたことから，ALVの共感染の実態が証明された。この成果は本課題の目的を達成するうえで極めて重要で，今後は3つの分子クローン(Km_5666_Clone, KmN_77_Clone_AおよびKmN_77_Clone_B）の感染実験を優先して病変形成と感染細胞率の相関性を明らかにすべきと考えた。当初，計画していた項目3), 4) のグリオーマ由来培養細胞の作製と解析は感染分子クローンの感染実験と併行して取り組むことができる。以上の理由から進捗状況はおおむね順調に進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本課題は神経系ならびに心臓に病原性を示すALVの解析を通して，レトロウイルスの多様な病原性の分子基盤を解明することを目的とする。これまでにALVの病原性と疫学に幅広く応用可能なプロウイルス定量法をリアルタイム PCR技術を応用して確立することができた。さらに従来見逃されてきた ALVの共感染を証明することができた。また，感染分子クローンKmN_77_Clone_AおよびKmN_77_Clone_Bを用いた感染実験の成績から，FGVp_クラスターに分類される変異株は，Km_クラスターに属す株に比べて，心臓に対する病原性が高いことがわかった。いいかえれば，グリオーマと心筋異常の発生機序は異なり，グリオーマは感染細胞率に依存せずに形成されるが，心筋異常は感染細胞率と相関して発生し，感染細胞率が高いほど心筋異常が強く出現すると推察される。この仮説が成り立てばFGVの病変は腫瘍性と非腫瘍性に分けられることになる。以上の考察を踏まえ，次年度はFGVp_クラスターに分類される分子クローンKm5666, KmN_77_Clone_A, KmN_77_Clone_Bを用いてそれぞれの感染量を変化させて感染実験を行い，病変の程度，頻度，感染細胞率との相関性の有無を解析する。また，これら感染実験と併行してグリオーマ由来培養細胞の作製に取り組む。
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