Studies on the interaction between changes of molecules in exosomes and the development of enzootic bovine leukosis

• Project/Area Number: 23K21269
• Project/Area Number (Other): 21H02357 (2021-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2021-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 猪島 康雄 岐阜大学, 応用生物科学部, 教授 (20355184)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡田 彩加 岐阜大学, 応用生物科学部, 助教 (70784221) ; 高島 茂雄 岐阜大学, 糖鎖生命コア研究所, 准教授 (50537610) ; 松橋 珠子 近畿大学, 先端技術総合研究所, 講師 (60504355)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000); Fiscal Year 2024: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2023: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2022: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2021: ¥7,670,000 (Direct Cost: ¥5,900,000、Indirect Cost: ¥1,770,000)
• Keywords: エクソソーム / 牛伝染性リンパ腫 / バイオマーカー / マーカー

Outline of Research at the Start

牛伝染性リンパ腫ウイルス（BLV）感染牛のうち、リンパ腫を「発症」するのはわずか1～5%であり、BLV感染量が増加しても発症しない感染牛が圧倒的に多く、発症の原因はいまだ不明である。
本研究では、生体の健康状態により、内包する核酸とタンパク質の種類と量がダイナミックに変化する50～150nmサイズの細胞外小胞（エクソソーム）に着目した。エクソソーム内の核酸、タンパク質の挙動とリンパ腫発症との相関を解明し、発症に関わる生体内の因子を分子レベルで明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

牛伝染性リンパ腫ウイルス（BLV）感染牛のうち、リンパ腫を発症するのはわずか1～5%だけであり、BLV感染量が増加しても発症しない感染牛が圧倒的に多く、発症の原因はいまだ不明である。
本研究では、生体の健康状態により変化する、エクソソームが内包する核酸とタンパク質の挙動とリンパ腫発症との相関を解明し、発症に関わる生体内の因子を分子レベルで解明する。
本年度は、前年度から継続して、以下の研究を進めた。①大学附属および民間の酪農場、各地の食肉衛生検査所（と畜場）、農業共済組合家畜診療所の協力により、BLVに感染していない健康なホルスタイン牛34頭、リンパ腫を発症したホルスタイン牛33頭、合わせて67頭から血液を収集した。②牛の個体情報、血液検査・血液生化学データ、感染ウイルス量、等のデータを収集した。③67頭のうち、健康牛3頭、リンパ腫発症牛3頭の血液エクソソームが内包するmiRNAの種類と量をマイクロアレイ解析により網羅的に同定、健康牛とリンパ腫発症牛で比較した。
その結果、以下の研究成果を得た。マイクロアレイ解析により、4種のmiRNAがリンパ腫発症牛の血液エクソソーム中に現れるバイオマーカー候補として選択できた。4種のバイオマーカー候補となったmiRNAのうち、3種のmiRNAを検出するリアルタイムPCR法を確立することができた。そこで、血液エクソソーム中のリンパ腫発症バイオマーカー候補miRNA3種について、健康牛31頭、リンパ腫発症牛30頭の血液で解析したところ、それら3種のmiRNAは、リンパ腫発症牛の血液において、有意に上昇していることが明らかとなった。
以上より、これら3種のmiRNAは、血液エクソソーム中に現れるリンパ腫発症バイオマーカーとなる可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画通りに、大学附属および民間の酪農場、各地の食肉衛生検査所（と畜場）、農業共済組合家畜診療所から、BLVに感染していない健康なホルスタイン牛、リンパ腫を発症したホルスタイン牛から血液を収集できた。牛の個体情報、血液検査・血液生化学データ、感染ウイルス量、等のデータを収集できた。健康牛、リンパ腫発症牛の血液エクソソームが内包するmiRNAの種類と量をマイクロアレイ解析により網羅的に同定できた。マイクロアレイ解析をもとに、健康牛31頭とリンパ腫発症牛30頭の血液エクソソーム内包miRNAを比較することができた。
その結果、リンパ腫発症を反映する血液エクソソーム中のmiRNAをバイオマーカーとして複数種類同定することができ、それらを検出するためのリアルタイムPCR検出系の確立にも成功した。
従って、現在までおおむね順調に計画が進展していると考えられるから。

Strategy for Future Research Activity

前年度に引き続き、BLVに感染していない健康牛、BLVに感染しているがリンパ腫を発症していないBLV感染初期から感染後期牛、およびBLVに感染しリンパ腫を発症した牛の生乳と血液を収集する。
以下の項目とエクソソーム内包分子の動態との相関、およびBLV感染からリンパ腫発症までのステージを区分し、リンパ腫発症までのモニタリング検査に適した標的分子の組み合わせを明らかにする。
牛の月齢、白血球数、リンパ球数、トータルLDH、LDHアイソザイム、感染ウイルス量、その他。
さらにリンパ腫発症に至るプロセスを分子レベルで明らかにする。

Research Products

• [Journal Article] 肉用牛における牛伝染性リンパ腫ウイルス感染と枝肉成績との関連 (2024)
  • Author(s): 松橋珠子、朝川昇、村瀬華梨、加藤大樹、松本和也、猪島康雄、白木琢磨
  • Journal Title: 肉用牛研究会報 Volume: 116 Pages: 30-30
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches (2024)
  • Author(s): Welsh, J. A., Goberdhan, D. C. I., O’Driscoll, L., Buzas, E. I., Blenkiron, C., Bussolati, B., Cai, H., Di Vizio, D., Driedonks, T. A. P., Erdbrugger, U., Falcon-Perez, J. M., Fu, Q.-L., Hill, A. F., Lenassi, M., Lim, S. K., Mahoney, M. G., Mohanty,.. .Kumagai, Y.,... Witwer, K. W
  • Journal Title: Journal of Extracellular Vesicles Volume: 13 Issue: 2
  • DOI: 10.1002/jev2.12404
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Exploration of microRNA biomarkers in blood small extracellular vesicles for enzootic bovine leukosis (2023)
  • Author(s): Takada Akane、Kamatari Yuji O.、Shimizu Kaori、Okada Ayaka、Inoshima Yasuo
  • Journal Title: Microorganisms Volume: 11 Issue: 9 Pages: 2173-2173
  • DOI: 10.3390/microorganisms11092173
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Characterization of mRNA signature in milk small extracellular vesicles from cattle infected with bovine leukemia virus (2023)
  • Author(s): Rahman Md. Matiur、Ishikawa Hinata、Yamauchi Marika、Takashima Shigeo、Kamatari Yuji O.、Shimizu Kaori、Okada Ayaka、Inoshima Yasuo
  • Journal Title: Pathogens Volume: 12 Issue: 10 Pages: 1239-1239
  • DOI: 10.3390/pathogens12101239
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identification of Suitable Internal Control miRNAs in Bovine Milk Small Extracellular Vesicles for Normalization in Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (2023)
  • Author(s): Rahman Md. Matiur、Nakanishi Ryoka、Tsukada Fumi、Takashima Shigeo、Wakihara Yoshiko、Kamatari Yuji O.、Shimizu Kaori、Okada Ayaka、Inoshima Yasuo
  • Journal Title: Membranes Volume: 13 Issue: 2 Pages: 185-185
  • DOI: 10.3390/membranes13020185
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Measures to Control Adult Houseflies (<i>Musca domestica</i>) And Stable Flies (<i>Stomoxys calcitrans</i>) To Prevent the Spread of Viral Diseases in Cattle Barns (2023)
  • Author(s): 清水薫、岡田彩加、猪島康雄
  • Journal Title: Journal of the Japan Veterinary Medical Association Volume: 76 Issue: 6 Pages: e149-e156
  • DOI: 10.12935/jvma.76.e149
  • ISSN: 0446-6454, 2186-0211
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 牛伝染性リンパ腫ウイルス感染を早期に検出する新規バイオマーカーの探索 (2023)
  • Author(s): 車取侑香、古谷眞椰、猪島康雄、松本和也、白木琢磨、松橋珠
  • Journal Title: 肉用牛研究会報 Volume: 114 Pages: 28-28
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparing microRNA in milk small extracellular vesicles among healthy cattle and cattle at high risk for bovine leukemia virus transmission (2022)
  • Author(s): Nakanishi Ryoka、Takashima Shigeo、Wakihara Yoshiko、Kamatari Yuji O.、Kitamura Yuko、Shimizu Kaori、Okada Ayaka、Inoshima Yasuo
  • Journal Title: Journal of Dairy Science Volume: 105 Issue: 6 Pages: 5370-5380
  • DOI: 10.3168/jds.2021-20989
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Identification of Potential mRNA Biomarkers in Milk Small Extracellular Vesicles of Enzootic Bovine Leukosis Cattle (2022)
  • Author(s): Hiraoka Mami、Takashima Shigeo、Wakihara Yoshiko、Kamatari Yuji O.、Shimizu Kaori、Okada Ayaka、Inoshima Yasuo
  • Journal Title: Viruses Volume: 14 Issue: 5 Pages: 1022-1022
  • DOI: 10.3390/v14051022
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Characterization of miRNAs in Milk Small Extracellular Vesicles from Enzootic Bovine Leukosis Cattle (2022)
  • Author(s): Tsukada Fumi、Takashima Shigeo、Wakihara Yoshiko、Kamatari Yuji O.、Shimizu Kaori、Okada Ayaka、Inoshima Yasuo
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 23 Issue: 18 Pages: 10782-10782
  • DOI: 10.3390/ijms231810782
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Comprehensive Proteomic Analysis Revealed a Large Number of Newly Identified Proteins in the Small Extracellular Vesicles of Milk from Late-Stage Lactating Cows (2021)
  • Author(s): Rahman Md. Matiur、Takashima Shigeo、Kamatari Yuji O.、Shimizu Kaori、Okada Ayaka、Inoshima Yasuo
  • Journal Title: Animals Volume: 11 Issue: 9 Pages: 2506-2506
  • DOI: 10.3390/ani11092506
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Proteomic profiling of milk small extracellular vesicles from bovine leukemia virus-infected cattle. (2021)
  • Author(s): Rahman MM, Takashima S, Kamatari YO, Badr Y, Kitamura Y, Shimizu K, Okada A, Inoshima Y
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 11 Issue: 1 Pages: 2951-2951
  • DOI: 10.1038/s41598-021-82598-2
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Putative Internal Control Genes in Bovine Milk Small Extracellular Vesicles Suitable for Normalization in Quantitative Real Time-Polymerase Chain Reaction (2021)
  • Author(s): Rahman Md. Matiur、Takashima Shigeo、Kamatari Yuji O.、Badr Yassien、Shimizu Kaori、Okada Ayaka、Inoshima Yasuo
  • Journal Title: Membranes Volume: 11 Issue: 12 Pages: 933-933
  • DOI: 10.3390/membranes11120933
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Bovine leukemia virus genotype surveillance in cattle at a slaughterhouse in Aichi Prefecture, Japan, in 2019 using polymerase chain reaction combined with restriction fragment length polymorphism (2021)
  • Author(s): Sahashi Yuma、Oshima Masaaki、Yamagishi Junjiro、Muramatsu Chieko、Shimizu Kaori、Inoshima Yasuo
  • Journal Title: Journal of Veterinary Medical Science Volume: 83 Issue: 11 Pages: 1730-1734
  • DOI: 10.1292/jvms.21-0234
  • NAID: 130008116864
  • ISSN: 0916-7250, 1347-7439
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 生乳中のEBLバイオマーカー分子の探索 (2023)
  • Author(s): 猪島康雄
  • Organizer: 動物用ワクチンーバイオ医薬品研究会 2023年度シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Identification of suitable internal control mRNAs and miRNAs in bovine milk small extracellular vesicles for normalization in quantitative real-time polymerase chain reaction (2023)
  • Author(s): Md. Matiur Rahman, Ryoka Nakanishi, Fumi Tsukada, Shigeo Takashima, Yuji O. Kamatari, Kaori Shimizu, Ayaka Okada, Yasuo Inoshima
  • Organizer: International Society for Extracellular Vesicles 2023 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 肉用牛における牛伝染性リンパ腫ウイルス感染と枝肉成績との関連 (2023)
  • Author(s): 松橋珠子、朝川昇、村瀬華梨、加藤大樹、松本和也、猪島康雄、白木琢磨
  • Organizer: 第60回(令和５年)肉用牛研究会
• [Presentation] 牛伝染性リンパ腫発症を反映する血液エクソソーム内包miRNAバイオマーカーの探索 (2022)
  • Author(s): 高田秋音、 松橋珠子、 岡田彩加、 猪島康雄
  • Organizer: 令和4年度獣医学術中部地区学会
• [Presentation] 牛伝染性リンパ腫ウイルス感染ステージによる生乳エクソソームに含まれるhsa-miR-424-5pの動態 (2022)
  • Author(s): 守安政太、 岡田彩加、 猪島康雄
  • Organizer: 令和4年度獣医学術中部地区学会
• [Presentation] 血液エクソソームにおける牛伝染性リンパ腫発症を反映するmiRNAバイオマーカーの探索 (2022)
  • Author(s): 高田秋音、 松橋珠子、 岡田彩加、 猪島康雄
  • Organizer: 第165回日本獣医学会
• [Presentation] 牛伝染性リンパ腫ウイルス感染牛のウイルスコピー数と生乳エクソソーム中のhsa-miR-424-5p内包量との相関 (2022)
  • Author(s): 守安政太、 岡田彩加、 猪島康雄
  • Organizer: 第165回日本獣医学会
• [Presentation] 牛伝染性リンパ腫発症を反映する血液エクソソーム内包miRNAバイオマーカーの探索 (2022)
  • Author(s): 高田秋音、 松橋珠子、 岡田彩加、 猪島康雄
  • Organizer: 第40回日本獣医師会獣医学術学会年次大会
• [Presentation] Development of a monitoring method for high risk cattle of bovine leukemia virus transmission and onset of enzootic bovine leukosis using milk exosomes (2022)
  • Author(s): Md. Matiur Rahman, Shigeo Takashima, Yuji O. Kamatari, Kaori Shimizu, Ayaka Okada, Yasuo Inoshima
  • Organizer: 第29回アジア獣医師会連合(FAVA)大会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] リアルタイムPCRのノーマライゼーションに用いる牛乳エクソソーム中の内在性コントロールmiRNAsの同定 (2022)
  • Author(s): エムディ マティウル ラハマン, 中西諒花, 塚田文, 清水薫, 岡田彩加, 猪島康雄
  • Organizer: 第9回日本細胞外小胞学会
• [Presentation] 生乳エクソソーム中miRNA量と牛伝染性リンパ腫ウイルス感染量との相関 (2022)
  • Author(s): 守安政太、髙田秋音、岡田彩加、猪島康雄
  • Organizer: 第9回日本細胞外小胞学会
• [Presentation] 地方病性牛伝染性リンパ腫発症牛の生乳エクソソーム内包mRNA解析と発症バイオマーカーの探索 (2021)
  • Author(s): 平岡真実, 脇原祥子, 高島茂雄, 葛岡功弥子, 岡田彩加, 猪島康雄
  • Organizer: 令和3年度獣医学術中部地区学会
• [Presentation] 生乳エクソソームを用いた地方病性牛伝染性リンパ腫発症リスクを反映するmiRNAバイオマーカーの探索 (2021)
  • Author(s): 塚田文, 脇原祥子, 高島茂雄, 葛岡功弥子, 岡田彩加, 猪島康雄
  • Organizer: 令和3年度獣医学術中部地区学会
• [Presentation] 地方病性牛伝染性リンパ腫発症牛における生乳エクソソーム内包mRNAの網羅的解析による発症バイオマーカーの探索 (2021)
  • Author(s): 平岡真実，脇原祥子，高島茂雄，葛岡功弥子，岡田彩加，猪島康雄
  • Organizer: 第164回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] 地方病性牛伝染性リンパ腫発症を反映する生乳エクソソーム内包miRNAバイオマーカーの探索 (2021)
  • Author(s): 塚田文, 脇原 祥子, 高島 茂雄, 葛岡 功弥子, 岡田 彩加, 猪島 康雄
  • Organizer: 第164回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] mRNA biomarkers in milk extracellular vesicles (2021)
  • Author(s): Md. Matiur Rahman, 高島茂雄, 鎌足雄司, Badr Yassien, 北村夕子, 清水薫, 岡田彩加, 猪島康雄
  • Organizer: 第164回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] 血中エクソソームに内包された牛枝肉成績バイオマーカーマイクロRNAの探索 (2021)
  • Author(s): 松橋珠子、笠原喜斗、加藤亜惟、茶原裕佳、池上春香、村瀬華梨、白木琢磨、松本和也
  • Organizer: 第164回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] 生乳エクソソーム内包miRNAの網羅的解析による地方病性牛伝染性リンパ腫の発症バイオマーカーの探索 (2021)
  • Author(s): 塚田文、脇原祥子、高島茂雄、葛岡功弥子、岡田彩加、猪島康雄
  • Organizer: 第8回日本細胞外小胞学会
• [Presentation] mRNA dynamics in milk extracellular vesicles in correlation with bovine leukemia virus copy number in cattle (2021)
  • Author(s): Md. Matiur Rahman, Shigeo Takashima, Yuji O. Kamatari, Yuko Kitamura, Kaori Shimizu, Ayaka Okada, Yasuo Inoshima
  • Organizer: 第8回日本細胞外小胞学会
• [Presentation] 地方病性牛伝染性リンパ腫発症牛の生乳エクソソームにおけるmRNAの網羅的解析と発症バイオマーカーの探索および有用性の検証 (2021)
  • Author(s): 平岡真実、脇原祥子、高島茂雄、葛岡功弥子、岡田彩加、猪島康雄
  • Organizer: 第8回日本細胞外小胞学会
• [Presentation] 牛伝染性リンパ腫ウイルスの感染を反映する新規血清マーカーの探索 (2021)
  • Author(s): 松橋珠子、讃井公隆、古谷眞椰、渡辺菜々、白木琢磨、松本和也
  • Organizer: 第8回日本細胞外小胞学会
• [Remarks] 岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科食品環境衛生学研究室 研究業績
  • URL: https://www.abios.gifu-u.ac.jp/education-member/vetpage/inoshima/achievement.html
• [Remarks] 岐阜大学応用生物科学部附属家畜衛生地域連携教育研究センターGeFAH 研究業績
  • URL: https://www.abios.gifu-u.ac.jp/gefah/achievement.html
• [Remarks] 岐阜大学応用生物科学部食品環境衛生学研究室 研究業績
  • URL: https://www.abios.gifu-u.ac.jp/education-member/vetpage/inoshima/achievement.html