２型志賀毒素B鎖５量体不安定性要因の分子機構解明と第２世代志賀毒素ワクチン開発

• Project/Area Number: 23K21276
• Project/Area Number (Other): 21H02367 (2021-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2021-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
• Research Institution: University of the Ryukyus
• Principal Investigator: 新川 武 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 教授 (50305190)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 玉城 志博 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 助教 (00720822)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000); Fiscal Year 2024: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2023: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2022: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2021: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
• Keywords: 2型志賀毒素ワクチン / 5量体分子安定化 / アミノ酸置換 / 毒素攻撃 / 生存率 / 2型志賀毒素ワクチン開発 / 動物実験 / 志賀毒素 / ワクチン / 5量体 / 分子安定性 / 変異体 / 豚の浮腫病 / 志賀毒素産生性大腸菌 / B鎖５量体 / ２型志賀毒素 / 分子不安定性要因解明

Outline of Research at the Start

2型志賀毒素（Stx2）に対する抗毒素ワクチンを開発するため、そのB鎖構造に特異的アミノ酸変異を導入することで、B鎖5量体の形成効率を高める。特にB鎖タンパク質同士が会合する際、その接着面として機能するアミノ酸郡に特異的変異を導入することで、大腸菌菌体内での会合効率を高め、B鎖5量体形成を促進させる。
本研究では、Stx2のうち特に豚に感染する病原性大腸菌が産生する「eバリアント」（Stx2e）を標的とした豚の浮腫病ワクチンの開発を目指しており、我々の過去の研究成果である第1世代浮腫病ワクチン「スイムジェンSTX」（2020年12月10日認可）に続く第2世代浮腫病ワクチンが完成する予定である。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、第一世代の志賀毒素ワクチンのうち、特に豚の浮腫病ワクチンに引き継続き、第2世代志賀毒素ワクチンを開発する。この第一世代豚浮腫病ワクチンは、Stx2eB鎖と同じく5量体形成するCOMPコイルドコイル分子（「結束分子」）を融合させたStx2eB-COMPである（COMP: Cartilage oligomeric matrixprotein）。このStx2eB-COMPは、分子的に不安定なStx2eB鎖を同じく5量体を形成するCOMPと融合させることで、Stx2eB鎖本来の分子不安定性を克服することを狙ったものである。本研究は、この第一世代ワクチン（Stx2eB-COMP）から一歩さらに進んで、第二世代ワクチンを開発することを目的としているが、その前にまず、Stx2B鎖5量体の不安定性要因を分子レベルで解明する必要がある。したがって、本研究では、Stx2B鎖5量体の（1）不安定性要因を分子レベルで解明し、その知見に基づき、（2）Stx2に対する第二世代ワクチンを開発する。これまで110種類程度のStx2B鎖変異体を構築し、5量体分子安定性を解析した結果、2か所の非常に重要なアミノ酸残基（位置）を特定するに至った。すなわち、これら2か所に位置するアミノ酸を適切なアミノ酸に置換することで、Stx2B鎖5量体の分子安定性が格段向上することを見出した。

より具体的には以下の手順で研究を進めた。
１．Stx2を用いた毒素攻撃試験系（マウス）を確立した。すなわち、まずStx2e産生性大腸菌（STEC）からStx2e毒素を分離精製した（玉城）。次に、精製Stx2eを用いてマウスの半数致死量を決定した（玉城）。
２．タンパク質産生に成功した上述の2つの変異体を含む数種類の変異体を精製し、上記1で確立したマウスの毒素攻撃試験系で各変異体のワクチン機能を検証した（新川）。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

これまで100種類以上のStx2B鎖変異体を構築し、5量体分子安定性を解析した。その結果、2か所の非常に重要アミノ酸残基を特定することに成功した。すなわ
ち、これら2か所を適切なアミノ酸に置換することで、Stx2B鎖5量体の分子安定性が格段向上することを見出した。この成果は、今後第二世代志賀毒素ワクチンを
開発するうえで必須の知見であると同時に高い独自性と特許性をもつ成果であると言える。したがって、この成果に基づき、本事業は「当初計画以上に進展して
いる。」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

これまで110種類程度のStx2B鎖変異体を構築し、5量体分子安定性を解析した結果、2か所の非常に重要なアミノ酸残基（位置）を特定した。すなわち、これら2
か所に位置するアミノ酸を適切なアミノ酸に置換することで、Stx2B鎖5量体の分子安定性が格段向上することを見出した。今後、この2か所の位置に複数の変異を挿入することで、さらに詳細に分子安定性を解析する必要があり、その知見に基づき、第二世代志賀毒素ワクチン開発の基盤技術とする。