Replacement of mitochondrial genome with synthesized DNA

• Project/Area Number: 23K21304
• Project/Area Number (Other): 21H02467 (2021-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2021-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43060:System genome science-related
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 和田 健一 九州大学, 工学研究院, 特任准教授 (20525919)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000); Fiscal Year 2025: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000); Fiscal Year 2024: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000); Fiscal Year 2023: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2021: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000)
• Keywords: mtDNA / 合成ゲノム / ミトコンドリア / マイクロ流体デバイス / 合成DNA / ゲノムライティング / ホモプラズミー / ミトコンドリアゲノム / ミトコンドリア移植 / 不和合性

Outline of Research at the Start

ミトコンドリアゲノム（mtDNA）に対する実用的な改変技術が開発されていないため，その機能解析の実施は大きく制限されている．合成DNAによるmtDNAの全置換は真に自由自在なmtDNA改変を実現する革新的なアプローチである．本研究では，合成DNAをミトコンドリアで機能する自己複製子として受容するように機能改変された細胞（外来mtDNA受容細胞）の創出を軸として，合成DNAによるmtDNAの全置換を可能にする技術体系の開発に取り組む．

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリアゲノム（mtDNA）は約16.5kbの環状DNAであり，動物細胞における唯一の核外ゲノムである．エネルギー産生に関わる遺伝子群をコードしており，個体の生存に必須な極めて重要なゲノムであるが，実用的な改変技術が開発されていないためその機能解析の実施が大きく制限されている．本研究は真に自由自在なmtDNAの改変を可能にする合成DNAによるmtDNAの全置換の実現を目指しており，この目標を達成するために以下の3つの課題を設定した．すなわち，外来mtDNA受容細胞の創出（課題１），外来mtDNA受容細胞を用いた合成DNAに由来する自己複製子の構築（課題２），合成mtDNAによる内在性mtDNA置換の実現とその機能解析（課題３），である．
2022年度までに，課題１で計画した外来mtDNA受容細胞の有力な候補細胞を一系統得ることに成功した．この進捗に基づいて，2023年度は，その他の外来mtDNA受容細胞を得るための試行を継続するとともに，すでに得られた外来mtDNA受容細胞の候補細胞を用いて合成mtDNAに由来する自己複製子の構築を目指した試行（課題２）を行なった．具体的には，得られた候補細胞の外来mtDNA受容細胞としての機能評価を進め，外来mtDNA受容細胞として必須な性状を備えていることを確認した．第二に，この細胞に対するミトコンドリア移植と定着方法の検討を行ない，合成mtDNAの導入の際に必要なミトコンドリア移植条件の検討を行なった．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度までに，一系統のみではあるが，外来mtDNA受容細胞として機能する有力な候補細胞を得ることができた．この進捗に基づいて研究３年目にあたる2023年度は，研究計画の通り，得られた外来mtDNA受容細胞の候補細胞を用いてDNAに由来する自己複製子の構築を目指した以下の実験を実施した．
まず初めに，得られた候補細胞がmtDNA受容細胞として機能するための性質を備えているか検討を行なった．具体的には，ピルビン酸／ウリジン添加培地で3ヶ月以上の長期培養を行なっても良好な細胞増殖能力を呈し，且つ，ホモプラズミックなmtDNA組成が維持されていることを確認した．次に，ピルビン酸／ウリジン不含の条件下では速やかに増殖が停止し，その後死滅することを確認した．即ち，ピルビン酸／ウリジンに対する栄養要求性があることを明らかにした．さらに，この候補細胞に対してHeLa細胞を脱核して得た細胞質体を融合させるとでミトコンドリアを移植したところ，およそ移植後3ヶ月程度で候補細胞のmtDNAがHeLa細胞由来のmtDNAに完全に置換されるとともに，ピルビン酸／ウリジンの栄養要求性が消失すること，即ちミトコンドリアの呼吸機能が回復することを確認した．これらの結果は，得られた候補細胞がヒトmtDNAに対する外来mtDNA受容細胞として機能することを示唆するものである．さらに，現在，この候補細胞に対する合成DNAの導入に必要と想定される細胞質体の融合以外の種々のミトコンドリア移植方法を検討している．これらの状況により，本研究課題は概ね順調に進展していると考えている．

Strategy for Future Research Activity

現在のところ，得られた候補細胞を用いた合成DNAに由来する自己複製子の構築には成功していない．この課題は2024年度までの実施が計画されているため，今後もこの課題を継続する．具体的には，2024年度は以下の二つの研究課題を軸に，合成DNAに由来する自己複製子の構築に向けた研究課題を推進する予定である．
（１）新規外来mtDNA受容細胞候補の取得：これまでに異種間ハイブリッドのスクリーニングから，外来mtDNA受容細胞の有力な候補を一系統得ることに成功しているが，これが外来mtDNA受容細胞として機能する保証はない．そのため，同様のアプローチを継続し，その他の新規mtDNA受容細胞の候補を得る．これに加えて，独自のマイクロ流体デバイスを用いたmtDNA改変技術を用いた外来mtDNA受容細胞の樹立も進める．これらの試行を通じて，合成DNAに由来する自己複製子の構築を可能にする外来mtDNA受容細胞の樹立を目指す．
（２）ミトコンドリアへのDNA導入方法の開発：合成DNAに由来する自己複製子の構築には，ミトコンドリアに対するDNA導入と，導入対象となったミトコンドリアを外来mtDNA受容細胞へ移植する技術が必須である．そのため，全細胞，脱核細胞，単離ミトコンドリア，膜抽出ミトコンドリア，等の様々な状態のミトコンドリアに対するDNA導入条件の検討を行うとともに，外来mtDNA受容細胞への移植と定着に必要な実験条件の検討を行う．

Research Products

• [Journal Article] Generation of transmitochondrial cybrids using a microfluidic device (2022)
  • Author(s): Wada Ken-Ichi、Hosokawa Kazuo、Ito Yoshihiro、Maeda Mizuo、Harada Yui、Yonemitsu Yoshikazu
  • Journal Title: Experimental Cell Research Volume: 418 Issue: 1 Pages: 113233-113233
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2022.113233
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] マイクロ流体デバイスを用いたミトコンドリアゲノム置換 (2021)
  • Author(s): 和田健一．細川和生．伊藤嘉浩，前田瑞夫
  • Journal Title: 化学とマイクロ・ナノシステム Volume: 20 Pages: 40-43
  • Open Access
• [Presentation] 異種間ハイブリッドにおける染色体とmtDNAの動態 (2023)
  • Author(s): 和田健一，細川和生，前田瑞夫，伊藤嘉浩，原田結，米満吉和，山西陽子
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
• [Presentation] マイクロ流体デバイスを用いて単一細胞間の細胞質移植を制御する (2023)
  • Author(s): 和田健一
  • Organizer: 流体医工学セミナー
  • Invited
• [Presentation] マイクロ流体デバイスを用いたミトコンドリアゲノム改変技術 (2022)
  • Author(s): 和田健一
  • Organizer: 第28回日本遺伝子細胞治療学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] マイクロ流体デバイスを用いたオルガネラ組成操作 (2021)
  • Author(s): 和田健一、細川和生、伊藤嘉浩、前田瑞夫
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会
• [Presentation] マイクロ流体デバイスを用いたミトコンドリアゲノム置換 (2021)
  • Author(s): 和田健一、細川和生、伊藤嘉浩、前田瑞夫
  • Organizer: 化学とマイクロ・ナノシステム学会 第43回研究会（CHEMINAS43）
• [Presentation] Generation of transmitochondrial cybrid using a microfluidic device (2021)
  • Author(s): Ken-Ichi Wada, Kazuo Hosokawa, Yoshihiro Ito, Mizuo Maeda, Yui Harada, Yoshikazu Yonemitsu
  • Organizer: The 25th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (MicroTAS 2021)
  • Int'l Joint Research