| Project/Area Number |
23K21305
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| Project/Area Number (Other) |
21H02468 (2021-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43060:System genome science-related
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
町田 幸大 兵庫県立大学, 工学研究科, 准教授 (20553093)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野井 健太郎 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 特任助教 (30588405)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2021: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
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| Keywords | 合成生物学 / 変異型アクチン / 試験管内再構成 / ヒトベータアクチン / N末端修飾 / 試験管内 / 再構成 / 試験管内生合成 / ヒトアクチン / バイオジェネシス / 再構成型タンパク質合成系 |
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| Outline of Research at the Start |
近年、アクチン遺伝子の突然変異と各種疾患の関連性が明らかにされた。しかしながら、これらの変異が実際にはどのように、アクチン「重合」や、その前段階である「翻訳」と「フォールディング」に影響しているかについては解明されていない。なぜなら、変異型アクチンのバイオジェネシスを解析するための適切な実験系が存在しなかったからである。そこで本研究では、アクチンのバイオジェネシスを試験管内で再現できるようにすると共に、「翻訳」「フォールディング」「重合」の各段階における正常型アクチンと変異型アクチンの機能の差を明らかにするための実験系を樹立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、試験管内合成したヒトのベータアクチンタンパク質のN 末端にアルギニン化修飾を行うため、ヒトのアルギニン転移酵素（ATE1）をクローニングし、発現・精製を行った。このATE1 を添加したヒト因子由来再構成型タンパク質合成系で、野生型アクチン（N 末端DDD）をコードするPlasmid DNA を用いてアクチンタンパク質を合成した。比較対象として、N 末端にアルギニンを付加した変異型アクチン（N 末端RDDD）も合成した。これら合成したサンプルをウエスタンブロッティングにより解析した。その結果、野生型アクチン（N 末端DDD）の約40% が、N 末端アルギニン化アクチンと同じ移動度にシフトしていた。これはすなわち、ATE1 を添加した再構成型翻訳システム内で新規に合成された野生型アクチンの約40% がアルギニン化されたことを示す結果であった。また線維化したアクチンをLifeact-EGFPで蛍光標識し共焦点顕微鏡による解析を行った結果、ATE1存在下で合成したアクチンの方がATE1非存在下で合成したアクチンよりも線維が長いものが観察され、アクチンのN末端アルギニン化は線維化促進に寄与していることを示唆する結果が得らえた。以上の一連の結果は、ヒト因子由来再構成型タンパク質合成系でヒトのベータアクチンの合成、フォールディング、修飾をワンポットで再現できることを示すものであり、修飾酵素を活性のある状態で調製できさえすれば、アクチン以外のタンパク質においても応用できる可能性が高く、翻訳中あるいは翻訳後修飾を試験管内で解析するための画期的な研究ツールとなることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アクチンのN末端アルギニン化については、リコンビナントで調整したATE1を利用して試験管内修飾がうまくいったため。共同研究者に所属の移動があったため、HS-AFMを利用した線維化の解析は当初の予定通りには進んでいないが、本学に設置された共有機器の共焦点顕微鏡を利用して解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までで、ヒト因子由来の再構成型タンパク質合成系内でヒトのベータアクチンを合成し、フォールディングさせ、線維化させることに成功し、疾患に関わる変異体と野生型との差が、アクチンバイオジェネシスのどの段階で現れるのかを明らかにすることができている。また細胞サイズのリポソーム内で上記アクチンの線維化までも再現できており人工細胞様プロトセルの基礎も確立できたと言える。加えて、アクチンの線維化に影響を与えるとされるN末端アルギニン化修飾についても解析できるようになってきた。後は、当初の計画にあったHS-AFMを利用した線維化のリアルタイム解析であるため、最終年度の本年度は特にHS-AFMによる解析を進めて行きたい。
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