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USP8による多彩なメンブレントラフィック制御の分子機構とその生理的・病理的意義

Research Project

Project/Area Number 23K21308
Project/Area Number (Other) 21H02474 (2021-2023)
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeMulti-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023)
Section一般
Review Section Basic Section 44010:Cell biology-related
Research InstitutionInstitute of Science Tokyo

Principal Investigator

駒田 雅之  東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (10225568)

Project Period (FY) 2021-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
Fiscal Year 2021: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Keywordsメンブレントラフィック / 脱ユビキチン化酵素 / USP8 / クッシング病
Outline of Research at the Start

脱ユビキチン化酵素USP8はエンドサイトーシス、オートファジー、エキソサイトーシスなどの細胞内小胞輸送(メンブレントラフィック)経路を制御することが明らかになりつつある。本研究では、USP8がこれらの輸送を制御するしくみを分子レベルで解明し、複数の経路が合目的的に調節されることを明らかにする。一方、難治性疾患クッシング病は、USP8に遺伝子変異が生じて発症することがわかっている。本研究では、変異型USP8が小胞輸送の異常を介してクッシング病を引き起こす分子機構も明らかにする。最終的に、USP8を介した多彩なメンブレントラフィックの制御を統合的に理解し、その生理的・病理的意義を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、複数のメンブレントラフィック経路をUSP8が制御する分子機構を解明することを目指している。
USP8によるエンドソームを介したメンブレントラフィックの制御については、これまでにUSP8の標的としてエンドソームの膜融合を担うSNAREタンパク質VAMP8などを同定していた。今年度の解析により、エンドソームに存在するユビキチンリガーゼRFFLが VAMP8をユビキチン化すること、形成されるユビキチン鎖はLys27連結型であること、SNARE複合体を形成していないVAMP8よりも形成しているVAMP8の方がよりユビキチン化を受けていることがわかった。さらに、細胞分裂期にはUSP8が活性化し、これを反映してVAMP8のユビキチン化レベルが減少することがわかり、USP8-VAMP8を介したメカニズムにより細胞分裂期のエンドソーム動態が制御される可能性が示された。
HIV1型レンチウイルスの感染細胞からの出芽の制御については、これまでに、USP8がウイルス構造タンパク質Gagを脱ユビキチン化するとGagとウイルスRNAの相互作用が弱まる可能性を見出していた。今年度は、ウイルスRNAをMS2 -MCPシステムで標識し、Gagのユビキチン化がGagとウイルスRNAの結合に重要であることを実証した。さらに、ユビキチン結合タンパク質であるALIXがGagとウイルスRNAの相互作用を仲介している可能性が示された。
クッシング病で見られる変異型USP8は過剰な酵素活性をもち、ACTHの分泌を過剰に促進して疾患発症を引き起こす。変異型USP8が脱ユビキチン化されるタンパク質を網羅的に同定するため、Split-TurboID法を応用し、変異型USP8に結合するユビキチン化タンパク質を濃縮する新手法の開発を進めた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

エンドソームを介したメンブレントラフィックの制御については、これに含まれるSNAREタンパク質がユビキチン化されることは知られていたが、その意義はこれまで不明であった。本研究から、SNAREタンパク質のユビキチン化がSNARE複合体の乖離を阻害するという当初予想していなかった作業仮説を立てることができた。これを示すことができれば、メンブレントラフィック分野において重要な発見になると期待している。
レンチウイルス出芽の制御については、Gagのユビキチン化がGagとウイルスRNAの相互作用に重要であることを初めて示すことができた。さらに、詳細な分子機構を解析し、ユビキチン化されたGagにユビキチン結合タンパク質ALIXが結合し、Gag-ALIX複合体にウイルスRNAが効率的に結合するという作業仮説を構築することができた。これも、当初は予想していなかったモデルである。これを証明できれば、ウイルス粒子へのウイルスRNAの動員機構の理解を大きく進めることができると考えている。
クッシング病を引き起こす変異型USP8によるメンブレントラフィック制御を明らかにするため、まずは、変異型USP8の基質タンパク質を同定することを目指した。これまでに変異型USP8に結合するタンパク質をIP-MS法で多数同定してきたが、基質同定には有効でなかった。そこで、Split-TurboID法を応用した新手法の開発を行なった。TurboIDの分割部位など種々のパラメーターを最適化する必要があるとわかり、それらの技術的課題を一つずつ解決したことにより、広範な脱ユビキチン化タンパク質の基質同定を可能とする方法として完成しつつある。

Strategy for Future Research Activity

エンドソームと細胞膜やオートファゴソームの間のメンブレントラフィックについては、VAMP8のユビキチン化がSNARE複合体の乖離を抑制する(脱ユビキチン化がSNARE複合体の乖離を促進する)分子メカニズムの解明を進める。最終的に、このメカニズムを介してエンドソームと細胞膜やオートファゴソームの膜融合が制御されることを明らかにする。
HIV1型レンチウイルスの感染細胞からの出芽については、GagとALIXの結合様式やALIXとウイルスRNAの結合様式を調べ、USP8とALIXを介したウイルス形成制御の分子機構の解明を進める。
クッシング病で見られる変異型USP8によるメンブレントラフィック制御については、Split-TurboID法を応用した新手法を完成させ、変異型USP8の基質タンパク質を網羅的に調べる。同定された候補タンパク質その中からACTH分泌に関連するものを特定する。
次に、USP8によるメンブレントラフィック経路の制御の独立性/連動性を調べる。具体的には、細胞に野生型/変異型USP8を発現し、共免疫沈降-質量分析法によって結合タンパク質を同定する。同定したタンパク質の中から、特徴的な細胞内部位に局在化するものなどを選び、これらの発現抑制がUSP8の局在化/活性化/基質結合を阻害するか確認する。次に、同定した因子を発現抑制し、USP8を介したメンブレントラフィック経路の制御に及ぼす影響を解析することにより、各制御の独立性/連動性を明らかにする。

Report

(2 results)
  • 2022 Annual Research Report
  • 2021 Annual Research Report
  • Research Products

    (22 results)

All 2023 2022 2021 Other

All Int'l Joint Research (6 results) Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (11 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Invited: 3 results) Remarks (3 results)

  • [Int'l Joint Research] University of Paris/Necker Hospital for Sick Children/Papillomavirus National Reference Center(フランス)

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  • [Int'l Joint Research] The Rockefeller University/Penn State College of Medicine/Stanford University Medical School(米国)

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  • [Int'l Joint Research] McGill University/NIAID(カナダ)

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  • [Int'l Joint Research] University of Cambridge(英国)

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  • [Int'l Joint Research] Garvan Institute of Medical Research(オーストラリア)

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  • [Journal Article] A possible function of <i>Nik-related kinase</i> in the labyrinth layer of delayed delivery mouse placentas2023

    • Author(s)
      Hiroshi Yomogita, Hikaru Ito, Kento Hashimoto, Akihiko Kudo, Toshiaki Fukushima, Tsutomu Endo, Yoshikazu Hirate, Yoshihiro Akimoto, Masayuki Komada, Yoshiakira Kanai, Naoyuki Miyasaka, Masami Kanai-Azuma
    • Journal Title

      Journal of Reproduction and Development

      Volume: 69 Issue: 1 Pages: 32-40

    • DOI

      10.1262/jrd.2022-120

    • ISSN
      0916-8818, 1348-4400
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      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Molecular basis of ubiquitin-specific protease 8 autoinhibition by the WW-like domain2021

    • Author(s)
      Kakihara K, Asamizu K, Moritsugu K, Kubo M, Kitaguchi T, Endo A, Kidera A, Ikeguchi M, Kato A, Komada M, Fukushima T
    • Journal Title

      Communications Biology

      Volume: 4 Issue: 1 Pages: 1272-1272

    • DOI

      10.1038/s42003-021-02802-x

    • Related Report
      2021 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Cis-activity regulation of USP8 and STAMBPL1, two endosomal deubiquitinating enzymes, and role of dysregulation in disease onset2022

    • Author(s)
      柿原 慧遵, 駒田 雅之, 福嶋 俊明
    • Organizer
      TMiMS国際シンポジウム「New Frontiers in Ubiquitin Proteasome System」
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Molecular mechanisms underlying the over-activation of USP8 and USP48 by Cushing’s disease-associated mutations2022

    • Author(s)
      Gai Ando, Keijun Kakihara, Masayuki Komada, Toshiaki Fukushima
    • Organizer
      The International Symposium in Tokyo 2022 “Ubiquitin New Frontier “from Neo-Biology to Target Protein Degradation”
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Caspase-dependent STAMBPL1 cleavage promotes cell death through its C-terminal fragment with hyperactive deubiquitinating activity2022

    • Author(s)
      Keijun Kakihara, Masayuki Komada, Toshiaki Fukushima
    • Organizer
      The International Symposium in Tokyo 2022 “Ubiquitin New Frontier “from Neo-Biology to Target Protein Degradation”
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 脱ユビキチン化酵素USP8によるVAMP8の制御とその細胞質分裂における意義の解明2022

    • Author(s)
      西岡 柚香, 柿原 慧遵, 遠藤 彬則, 駒田 雅之, 福嶋 俊明
    • Organizer
      第45回 日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] Ubiquitination-mediated activation of AKT and its cancer-associated mutants2022

    • Author(s)
      Marsya Yonna Nurrachma, Beni Lestari, 駒田 雅之, 福嶋 俊明
    • Organizer
      第45回 日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] クッシング病を引き起こすUSP8の過剰活性化機構2022

    • Author(s)
      福嶋 俊明, 柿原 慧遵, 浅水 謙吾, 森次 圭, 北口 哲也, 駒田 雅之
    • Organizer
      第95回 日本生化学会大会シンポジウム「ユビキチンワールドを制御する脱ユビキチン化酵素の疾患、創薬における重要性」
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 脱ユビキチン化酵素USP8の遺伝子変異を介したクッシング病の発症メカニズム2022

    • Author(s)
      福嶋 俊明, 柿原 慧遵, 駒田 雅之
    • Organizer
      第27回 日本病態プロテアーゼ学会学術集会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Autoinhibition of USP8 by WW-like domain and the dysregulation in Cushing’s disease2022

    • Author(s)
      Keijun Kakihara, Kei Moritsugu, Tetsuya Kitaguchi, Akinori Endo, Masayuki Komada, Toshiaki Fukushima
    • Organizer
      EMBO Workshop “Ubiquitin and ubiquitin-like proteins in health and disease”
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] レンチウイルス粒子へのウイルスRNAの動員はGagのユビキチン化によって促進される2021

    • Author(s)
      氷見雄哉、柿原慧遵、加藤明、駒田雅之、福嶋俊明
    • Organizer
      第68回日本ウイルス学会学術集会
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  • [Presentation] 脱ユビキチン酵素USP8はレンチウイルス粒子へのウイルスRNAの動員を阻害することによってウイルスの増殖を防ぐ2021

    • Author(s)
      氷見雄哉、柿原慧遵、加藤明、駒田雅之、福嶋俊明
    • Organizer
      第44回日本分子生物学会年会
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  • [Presentation] Cushing’s disease-associated mutation releases autoinhibition of the deubiquitinating enzyme USP8.2021

    • Author(s)
      柿原慧遵、浅水謙吾、森次圭、北口哲也、遠藤彬則、木寺詔記、池口満德、駒田雅之、福嶋俊明
    • Organizer
      第44回日本分子生物学会年会
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  • [Remarks] 駒田研究室ウェブサイト

    • URL

      https://komada-lab.jimdofree.com/

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  • [Remarks] 駒田研究室ホームページ

    • URL

      https://komada-lab.jimdofree.com/

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  • [Remarks] Tokyo Tech News

    • URL

      https://www.titech.ac.jp/english/news/2021/062478

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Published: 2021-04-28   Modified: 2024-12-25  

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