| Project/Area Number |
23K21309
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| Project/Area Number (Other) |
21H02476 (2021-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
増田 章男 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (10343203)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石垣 診祐 滋賀医科大学, 神経難病研究センター, 教授 (40378170)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2021: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
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| Keywords | 天然変性領域 / スプライシング / 液ー液相分離 / RNA結合タンパク / 神経変性疾患 / エクソン / 相分離 / IDR |
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| Outline of Research at the Start |
筋萎縮性側索硬化症に代表される神経変性疾患では、RNA代謝異常が重要な病因であることが判明しています。しかし、RNA代謝が生理的にどのように行われているのか、その機構の詳細は、まだ十分に解明されていません。本研究では、RNA代謝を司るRNA結合タンパクの天然変性領域に焦点を当て、その配列とRNA代謝におけるルールを明らかにすることで、神経変性疾患の病態解明に迫ります。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Bioinformatics解析による天然変性領域 (IDR)の分類を行った。Annotation databaseからヒト蛋白の全配列情報を入手し、アミノ酸の組成/電荷/疎水性情報をもとにIDR領域配列の分類を行った。6種類のクラスターへの分別に成功し、IDRを持つRNA結合タンパク (RBP)が特に集積しているクラスターを2つ発見した。これら2つのクラスターは、特にIDR領域のアミノ酸電荷に違いが認められ、一方は無電荷、他方は激しく電荷を帯びていた。これら2つのクラスターに属するRBPから数個ずつRBPを選択し、それらのリコンビナント蛋白を作製し、in vitro 相分離実験を行ったところ、無電荷IDRと有電荷IDRは、著しく分離する（混和しない）ことが判明した。
続いて、これらIDRを持つRBPの細胞内分布を高精細に観察するため、サンプルの固定法から染色・検出法に至るまで様々な条件検討を行い、超解像顕微鏡を用いた免疫染色観察系、さらには、超解像顕微鏡観察に頼らないexpansion microscopy法の確立に成功した。確立手法を用いて培養細胞やマウス・ヒト組織切片の観察を行ったところ、20種以上のRBPがRNAと一体となって径10 nm程度のfiberを形成し、それらが複雑に絡み合った径100-400nmほどのポアサイズの網目構造を核内に広げていることを発見した。
細胞実験を行ったところ、無電荷IDRを持つRBPと有電荷IDRを持つRBPは、密接に絡み合うものの混和しない網目構造を核内で広げており、その空間分布の競合を行っていた。我々の開発したtRIP法により、生体内RBP-RNA結合解析をトランスクリプトームワイドに行ったところ、この競合が、RNA結合、さらにはRNA processingの制御につながっていることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
超解像顕微鏡実験系の構築により、RBPによる核内網目構造の同定に成功した。この構造は、全く新規の発見であるため、その検証に、別方式の超解像顕微鏡による観察や、さらには超解像顕微鏡によらないexpansion microscopy観察法など、当初予定していない観察系の構築が必要となった。様々な条件検討を行って、これら新規の観察系を立ち上げていくこととなったため、研究進捗状況が予定より遅れることとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
RBP網目構造によるRNA processing制御がどれほど汎用的な構造であるか確認するため、各種RBPの抗体染色による核内検出網目構造検出、各種RBPのtRIP解析、各種RBPのノックダウンによる機能解析を進めていく。
また、MATR3患者変異を導入した細胞実験系の確立し、RBP網目構造と病態の関係の解析を行う。
以上、研究成果を取りまとめ、速やかに論文発表を行っていく。
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