| Project/Area Number |
23K21379
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| Project/Area Number (Other) |
21H02741 (2021-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49060:Virology-related
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| Research Institution | Fujita Health University (2024)
Kobe University (2021-2023) |
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Principal Investigator |
定岡 知彦 藤田医科大学, その他部局等, 准教授 (00435893)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2021: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000)
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| Keywords | 水痘帯状疱疹ウイルス / 潜伏感染 / 再活性化 / 融合転写産物 / エピジェネティクス |
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| Outline of Research at the Start |
90%以上の人類に感染する水痘帯状疱疹ウイルスは、初感染で水ぼうそうを発症し、全身の中枢神経軸に沿った知覚神経節神経細胞に潜伏感染する。潜伏感染者ではその生涯においてほぼ一度だけ再活性化し、帯状疱疹を含む様々な病態を示す。知覚神経細胞での潜伏感染・再活性化の分子機構はいまだ不明な点が多い。本研究計画では、研究代表者が確立したヒトiPS細胞由来知覚神経細胞潜伏感染モデルを用いて、水痘帯状疱疹ウイルス潜伏感染・再活性化機構のさらなる理解を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画では、水痘帯状疱疹ウイルス（varicella-zoster virus; VZV）がヒト体内での潜伏感染標的細胞である知覚神経細胞での潜伏感染中に発現する、VZV潜伏感染遺伝子、VZV latency transcript:VLT、およびVLTと隣り合う遺伝子領域であるORF63との融合転写産物VLT-ORF63の、再活性化刺激に呼応した転写・タンパク発現制御機構解明を通した、潜伏感染獲得・維持・再活性化の機構を明らかにすることを目指している。昨年度までに、ヒトiPS細胞由来知覚神経細胞を用いた潜伏感染モデルにおいて、再活性化の各段階を従来のRNA発現解析より簡便な、蛍光タンパク発現により可視化できる遺伝子組換えVZV作製を完了し、再活性化刺激によりウイルス前初期遺伝子であるORF4のプロモーターに依存したGFP発現を確認している。本年度は、この実験モデルを用いて、潜伏感染でのエピジェネティック解析条件の検討、また再活性化刺激による知覚神経細胞での遺伝子発現変動より、VLT単独発現からVLT-ORF63融合遺伝子転写産物発現に関わる宿主遺伝子の同定を試みた。またVLT-ORF63融合遺伝子転写産物は、水ぼうそうや帯状疱疹といった病原性発揮に関わる溶解感染においても発現することから、抗体産生を誘導することを想定し、帯状疱疹発症後血清における抗体誘導を検討した。
以上の研究成果は、2023年度、International Herpesvirus Workshopにおいて１報発表し、2024年度、International Herpesvirus Workshopにおいて２報発表予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度までに、ヒトiPS細胞由来知覚神経細胞を用いた潜伏感染モデルにおいて、再活性化の各段階を従来のRNA発現解析より簡便な、蛍光タンパク発現により可視化できる遺伝子組換えVZV作製を完了し、再活性化刺激によりウイルス前初期遺伝子であるORF4のプロモーターに依存したGFP発現を確認することができたことより、実験モデルの改良を行うことができたが、当初の想定よりも時間を費やした。本改良モデルを用いたエピジェネティック解析として採用した CUT&Tagも、神経細胞を用いたプロトコルが確立されておらず、前年度にはシグナルが検出限界以下であるという問題点があったが、ヒトiPS細胞由来知覚神経細胞分化手法の改良による早期分化方法の確立と、細胞数に増加により、抑制性ヒストン修飾と、VLT発現を許容する転写因子修飾の再解析にこぎつけ、現在データ解析中である。
しかしながら、研究開始当初には想定していなかった、再活性化刺激に呼応した、VLT単独発現からVLT-ORF63融合遺伝子転写産物発現に関わる宿主遺伝子の同定を行い、神経細胞における標的遺伝子ノックダウンによるVLT-ORF63融合遺伝子転写産物発現低下を確認することができた。宿主遺伝子発現制御による潜伏感染維持・再活性化制御機構の解明への一歩が進んだ。
全体として、潜伏感染維持・再活性化に関わる宿主遺伝子発現制御機構に迫っていることは新たな進展として評価できると考えるが、昨年度までに完了予定であったエピジェネティック修飾の解析が終了していない点が標記の評価になると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、ヒトiPS細胞由来知覚神経細胞を用いた潜伏感染モデルより得られている、ウイルスゲノムの潜伏感染時エピジェネティック修飾データの解析を急ぐ。この解析データをもとに、宿主転写因子結合ウイルスゲノム領域への変異導入を開始し、潜伏感染モデルにおいて潜伏感染維持・再活性化に与える影響を検討する。さらにすでに本モデルより得られている潜伏感染ウイルスRNAの、nanoporeによるdirect RNA-seq解析を行い、RNA修飾を明らかにする。このデータとエピジェネティック修飾データを合わせることで、特に潜伏感染維持機構解明に焦点を当てた研究成果をまとめる。
また再活性化刺激に呼応した、VLT単独発現からVLT-ORF63融合遺伝子転写産物発現に関わる宿主遺伝子の同定は、VLT-ORF63融合遺伝子転写産物の転写後修飾に関わる遺伝子であることが明らかとなっている。そこで、この転写後修飾に関わるウイルスゲノム配列に変異を導入することで、VLT-ORF63融合遺伝子転写産物を発現できない遺伝子組み換えウイルスを作出し、ヒトiPS細胞由来知覚神経細胞を用いた潜伏感染モデルにおいてその効果を検討する。同時に、神経細胞における標的遺伝子ノックダウンにより、ウイルス再活性化に及ぼす影響も検討することで、ウイルス側面と宿主側面からの機能解析とし、研究成果を報告することを目指す。
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