基底レベルの感染防御を担うウイルス抑制シグナルの解明
| Project/Area Number |
23K21382
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| Project/Area Number (Other) |
21H02746 (2021-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49060:Virology-related
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
山根 大典 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, 主席研究員 (60782761)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
結城 明香 国立感染症研究所, 安全実験管理部, 主任研究官 (50450557)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2021: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
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| Keywords | 自然免疫 / インターフェロン制御因子 / 肝炎ウイルス / ウイルス |
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| Outline of Research at the Start |
宿主細胞は、ウイルス感染に応答してインターフェロン(IFN)をはじめとする抗ウイルスシグナルを活性化し抗ウイルス状態を形成すると考えられてきた。一方、肝細胞においてはIFNとは独立したウイルス抑制機構が存在し、その仕組みの一つとしてIRF1による基底レベルの抗ウイルス防御層が存在することを明らかにしてきた。本研究では、IRF1に加えて恒常的に機能していると考えられる他のIRFタンパク質(IRF2,-6,-8,-9)の活性制御機構および機能的役割について、培養細胞に加えて感染動物モデルの両面から詳細に解析する。これにより、ウイルス感染に対し基底レベルの防御層を担う自然免疫の仕組みを解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで重要視されてきたウイルスに「応答」して活性化されるシグナル伝達機構に対し、恒常的な抗ウイルス防御層を制御する仕組みについてはほとんど解明されていない。研究代表者らは、恒常的にウイルス感染を抑制する機能をもつことを既に見出しているIRF1について、翻訳後修飾を介した活性化機構の解析を行った。FLAGタグをもつIRF1を哺乳細胞内に過剰発現し、抗FLAG抗体を用いて分離精製したタンパク質の翻訳後修飾を調べたところ、リン酸化候補サイトを複数見出した。同定した候補アミノ酸残基をアラニン置換した変異体を作製し転写機能を調べたところ、これらのリン酸化サイトは転写活性に寄与しないことが判明した。
FLAG標識されたIRF1を分離精製する過程でIRF1に結合する宿主因子が同時に分離されることから、IRF1精製産物をショットガンプロテオミクスの手法を用いて解析したところ、多数の宿主因子をIRF1結合因子として見出した。これらの因子の中から、自然免疫および転写調節に関与することが報告されているものを絞り込み、遺伝子ノックダウン解析によりIRF1転写制御および抗ウイルス機能を評価したところ、CSNK2BをIRF1の抗ウイルス機能を促進する因子として同定した。CSNK2Bはカゼインキナーゼ2複合体のうちリン酸化酵素活性をもたない調節サブユニットであり、CSNK2BによるIRF1活性制御はIRF1のリン酸化を伴わないことが示唆された。
CSNK2BがIRF1を制御するメカニズムについて調べたところ、IRF1の標的DNA配列への結合親和性を有意に変化させることでIRF1の転写能を正に制御していることが判明した。これらの結果から、IRF1の抗ウイルス活性はIRF1の発現量のみならず、細胞内のCSNK2Bの発現状態によっても調節され得ることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまであまり着目されていなかった「基底レベル」で機能する抗ウイルスシグナル伝達機構であるが、タンパク質の分離精製手法を用いたインタラクトーム解析により、抗ウイルス転写因子であるIRF1に直接結合し、その転写活性を促進する因子としてCSNK2Bの同定に至った。IRF1は半減期が30分から1時間と短く、不安定であることがこれまでに報告されていることから、その機能は転写レベルで調節されていると長年考えられてきた。それに反し、本研究の結果からIRF1は翻訳後において、CSNK2Bを介した直接的な結合によっても転写機能が制御されることが明らかとなった。これらの成果を現在論文としてまとめており、国際学術誌に投稿中である。本研究において確立した標識タンパク質の精製手法は、タンパク質自体の翻訳後修飾のみならず、精製タンパク質と結合する宿主因子を網羅的に探索するインタラクトーム解析にも応用可能であることを示した。この手法は今後、IRF1以外の宿主抗ウイルス因子のシグナル伝達機構を解析するための重要な基盤となる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究により、基底レベルの抗ウイルスシグナル伝達を制御する因子として新たにCSNK2Bを見出したが、CSNK2BがIRF1のDNAへの結合を調節する分子メカニズムの詳細は未だ不明な点が残されている。CSNK2Bが直接IRF1に結合することでIRF1の標的親和性を変化させるような高次構造の変化をもたらしている可能性が示唆されることから、今後その作用機序を明らかにする必要がある。引き続きクロマチン免疫沈降法を用いたゲノムワイドなIRF1結合部位の探索から新たな抗ウイルス遺伝子の同定を試みている。
また、IRF1以外の抗ウイルス因子についても、引き続き遺伝子ノックダウンおよびノックアウト解析により解析を進め、同定を試みている。同定された新たな因子については、既に重要性が明らかとなっているIRF1との相互作用および抗ウイルス遺伝子の転写における協調関係を含め、これまでに構築したタンパク質精製、インタラクトーム解析、さらに標的DNAへの結合解析により、シグナル伝達の活性調節から下流のエフェクター分子に至る作用機序の解明を目指す。また、エフェクタ―の作用機序の解析から、肝炎ウイルスおよびデングウイルスを含むフラビウイルスを中心に、抗ウイルス作用をもつ化合物の同定の他、ウイルス感染症の病態を再現可能な小動物感染モデルを用いた解析へとつなげる。上記のアプローチにより、引き続き新たなウイルス培養システムの構築および抗ウイルス薬の開発を目指す。
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Report
(1 results)
Research Products
(14 results)
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[Journal Article] Development and Characterization of a Highly Sensitive NanoLuciferase-Based Immunoprecipitation System for the Detection of Anti-Influenza Virus HA Antibodies.2021
Author(s)
Honda T, Gomi S, Yamane D, Yasui F, Yamamoto T, Munakata T, Itoh Y, Ogasawara K, Sanada T, Yamaji K, Yasutomi Y, Tsukiyama-Kohara K, Kohara M.
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Journal Title
mSphere
Volume: 12
Issue: 3
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Macrocyclic peptides exhibit antiviral effects against influenza virus HA and prevent pneumonia in animal models2020
Author(s)
Saito, M Itoh Y, Yasui F, Munakata T, Yamane D, Ozawa M, Ito R, Katoh T, Ishigaki H, Nakayama M, Shichinohe S, Yamaji K, Yamamoto N, Ikejiri A, Honda T, Sanada T, Sakoda Y, Kida H, Le TH, Kawaoka Y, Ogasawara Tsukiyama-Kohara T, Suga H, & Kohara M
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Journal Title
Nature Comunications
Volume: -
Issue: 1
Pages: 2654-2654
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] A CBP/Β-CATENIN SIGNALING INHIBITOR, PRI-724 AMELIORATES NASH-INDUCED LIVER FIBROSIS AND DISORDER2022
Author(s)
Kenzaburo Yamaji, Yuko Tokunaga, Sadahiro Iwabuchi, Shinichi Hashimoto, Daisuke Yamane, Sakiko Toyama, Bouchra Kitab, Kiminori Kimura, Kyoko Tsukiyama-Kohara, Michinori Kohara
Organizer
AASLD2022
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