EMT関連形質を個別に誘導するTGF-βシグナル分岐経路の解析

• Project/Area Number: 23K21385
• Project/Area Number (Other): 21H02762 (2021-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2021-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 50010:Tumor biology-related
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 宮澤 恵二 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (40209896)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000); Fiscal Year 2024: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2023: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2022: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2021: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
• Keywords: EMT / がん悪性化 / TGF-β / Smad / ZEB1 / 上皮間葉転換 / シグナル伝達

Outline of Research at the Start

継続課題のため、記入しない。

Outline of Annual Research Achievements

Transforming growth factor-β(TGF-β)はEMT(上皮間葉移行)を誘導する代表的な細胞増殖因子であり、がん悪性化への関与もよく知られている。本研究はTGF-βによるがん細胞のEMT誘導シグナル伝達を研究材料として、①EMTに関連した各形質を誘導するシグナル伝達経路の分岐状況を検証すること ②がん悪性化に主要な役割を果たす分岐経路(形質変化)を同定することを目的としている。研究手法として、Smad3をはじめとする各種シグナル伝達因子のノックアウト細胞に変異体を再導入し、TGF-β刺激後の細胞応答回復状況を確認することにより検討を進めている。
TGF-β依存的に細胞形態変化およびアクチン細胞骨格再編成を誘導する経路について、昨年度までに転写因子Snailの誘導が必須であることを明らかにしている。令和5年度はSnail遺伝子を含むゲノム内のTAD（topolorigcally-associating domain）中でTGF-βに応答するエンハンサー配列を新たに同定し、Snailの遺伝子発現誘導をモニターするレポーター系の構築に成功した。これによりSnailの発現誘導に関与するSmad3の責任領域をマッピングする準備が整った。ストレス耐性のシグナル伝達については、Smad3の下流でALDH1A1が誘導されることが重要であるとの結果を得た。また、in vivoでの腫瘍移植実験（マウス尾静脈注射肺転移モデル）において、肺がん細胞の親株とSMAD3ノックアウト細胞株で腫瘍形成能に明確な差が観察される実験条件の設定が完了した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

TGF-β依存的なE-cadherinの発現低下に関与する経路が他経路と分岐していることは明らかにできたが、Smad3の責任領域の同定が進んでおらず、これが遅れにつながっている。E-cadherinをコードするCDH1遺伝子のプロモーター領域を利用したレポーターは、TGF-βに対する応答性が弱いことが同定を進める上でのネックとなった。一方、この細胞応答には転写因子ZEB1の機能的活性化が関与すること、ヒストン脱アセチル化酵素HDACの阻害剤によって抑制されることは見出している。今後は、リードアウトとして適切なレポーター系の構築を進め、責任領域の同定を急ぎたいと考えている。

Strategy for Future Research Activity

すでに責任領域を同定できた細胞応答（細胞運動性亢進）については、変異導入細胞を用いたin vivo実験に移行し、腫瘍形成における重要性の評価を進める。また、新たに構築したレポーター系を用いてTGF-βによるSnailの発現誘導に関与するSmad3の責任領域の同定を進める。さらに、E-cadherinの発現低下に関与するシグナル伝達経路の活性化を簡便にモニターするレポーター系の構築、責任領域の同定を急ぐ。Smad3の点変異体は多数準備しており、これらを用いる予定である。各種細胞応答に対する責任領域が同定できしだい、in vivo実験を開始する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Uppsala University(スウェーデン)
• [Journal Article] Receptor-activated transcription factors and beyond: multiple modes of Smad2/3-dependent transmission of TGF-β signaling (2024)
  • Author(s): Miyazawa Keiji、Itoh Yuka、Fu Hao、Miyazono Kohei
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 300 Issue: 5 Pages: 107256-107256
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2024.107256
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The Snail signaling branch downstream of the TGF-β/Smad3 pathway mediates Rho activation and subsequent stress fiber formation (2024)
  • Author(s): Motizuki Mitsuyoshi、Yokoyama Takashi、Saitoh Masao、Miyazawa Keiji
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 300 Issue: 1 Pages: 105580-105580
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2023.105580
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Smad2Δexon3 and Smad3 have distinct properties in signal transmission leading to TGF-β-induced cell motility. (2023)
  • Author(s): Yokoyama T, Kuga T, Itoh Y, Otake S, Omata C, Saitoh M, Miyazawa K.
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume: 299 Issue: 2 Pages: 102820-102820
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102820
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ndole-derived compound SIS3 targets a subset of activated Smad complexes. (2023)
  • Author(s): toh Y, Sawaguchi T, Fu H, Omata C, Saitoh M, Miyazawa K.
  • Journal Title: J Biochem. Volume: 173 Issue: 4 Pages: 283-291
  • DOI: 10.1093/jb/mvac104
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The TGF-β/Snail pathway regulates stress fiber formation and cell motility via activating RhoA (2023)
  • Author(s): Miyazawa, Keiji
  • Organizer: TGF-β meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] TGF-β/Smad3 promotes antioxidant function and chemoresistance (2023)
  • Author(s): Yokoyama, Takashi
  • Organizer: TGF-β meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] TGF-βシグナルによるZEB1依存的クロマチン制御を介したCDH1発現抑制機構 (2023)
  • Author(s): 大嶽茂雄、齋藤正夫、宮澤恵二
  • Organizer: 日本癌学会
• [Presentation] TGF-β/SMAD3によるALDH1A1の発現誘導を介したdoxorubicin耐性機構 (2023)
  • Author(s): 横山隆志、齋藤正夫、宮澤恵二
  • Organizer: 日本がん分子標的治療学会
• [Presentation] 酸化ストレスおよび抗がん剤耐性の促進に必要な SMAD3 機能ドメインの同定 (2022)
  • Author(s): 横山 隆志、齋藤 正夫、宮澤 恵二
  • Organizer: 日本がん分子標的治療学会