| Project/Area Number |
23K21496
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| Project/Area Number (Other) |
21H03147 (2021-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57060:Surgical dentistry-related
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
中原 貴 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (10366768)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
望月 真衣 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (90821934)
小林 朋子 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (10548283)
相良 洋 東京大学, 医科学研究所, 特任助教 (50145041)
中島 慎太郎 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (40817095)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2025: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2021: ¥7,280,000 (Direct Cost: ¥5,600,000、Indirect Cost: ¥1,680,000)
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| Keywords | 歯の再生 / 歯髄幹細胞 / 細胞シート / 再生歯インプラント / バイオ再生歯根 / 細胞培養 / 歯性幹細胞 / 自己多層化 / 無血清培養 / 間葉系幹細胞 / 器官培養 |
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| Outline of Research at the Start |
現在の歯科インプラント治療で使用されるチタン製人工歯根に対し、細胞・組織からなるバイオ再生歯根の実現が待望されている。本研究は、歯根・歯周組織ユニットの器官再生能を有する幹細胞群（Reg細胞群）の分離培養、および分離培養したReg細胞群の多方面解析による再生誘導因子の同定により、バイオ再生歯根の形成を可能とする普遍的な新規培養システム「器官再生法」の確立と再生誘導医薬の創出をめざす基盤研究である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在までに、歯根・歯周組織ユニットの器官再生に応用可能な歯性細胞群を得るため、歯科治療で抜去された智歯から歯髄組織を採取した。酵素処理（コラゲナーゼ／ディスパーゼ）により細胞を単離した後、ウシ胎仔血清を含まない無血清培養下で培養を行った。得られた細胞は、継代数3～4の段階で間葉系幹細胞（MSC）特性を評価するとともに、後述する自律的な多層構造の細胞シート形成能（自己多層化能）についても検証を行った。
MSC特性評価では、in vitro評価として、細胞増殖評価、フローサイトメーターを用いたMSCマーカーの表面抗原解析、mRNA／タンパクの遺伝子発現解析、骨芽細胞と脂肪細胞への多分化誘導実験を行ってMSC特性を明らかにした。また、in vivo評価では、骨補填材からなる細胞／基材複合体を移植して豊富な新生硬組織を認めた。以上の多角的な評価によって、高度なMSC特性を有する歯髄幹細胞を選別することができ、Regenerative（Reg）細胞群の候補となるヒト歯性細胞群の分離に成功した。
さらに、特許出願を完了した新規細胞シート技術となる「自己多層化細胞シート」の作製によって、無血清培養による持続的な細胞増殖と細胞外マトリックスの産生が維持されることを見出し、自律的に多層化して細胞シートを形成するユニークな能力（自己多層化能）を有する歯髄幹細胞群の存在を明らかにした。この細胞群の機能解析を続けることで、安定的・効果的に細胞シートが作製できる培養条件の確立を通じて、Reg細胞群の存在を示唆する知見を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの進捗として、無血清培養下で得られた歯髄幹細胞をin vitro／in vivoの両面から評価し、歯根・歯周組織ユニットの器官再生に資するReg細胞群の候補集団の探索を行った。In vitroでは、複数のMSCマーカー（CD29, CD44, CD73, CD90, CD105陽性）を有し、骨・脂肪への多分化能を確認した。In vivoでは、歯髄幹細胞と骨補填材の複合体を移植し、新生硬組織の形成を豊富に認めた。これらの結果から、分離した細胞は高い増殖能とMSC特性を備えた歯髄幹細胞であることを同定した。
無血清培養下の細胞増殖評価の過程でわれわれは、歯髄幹細胞において自律的に多層構造を形成する「自己多層化能」を示すユニークな細胞群が存在する知見を得た。この細胞群は、持続的な増殖と細胞外マトリックス産生による多層化を両立することによって、これまでの単層構造からなる細胞シート技術では困難だった多層化細胞シートを形成する自己多層化能を備えており、特許出願によって新たな再生医療技術を創出するに至った。これらの成果は、自己多層化能を備えたユニークな細胞群がReg細胞群として、歯根・歯周組織ユニットの器官再生を実現する新たな可能性を示唆している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、歯髄幹細胞が示す自己多層化能に着目し、それによって形成される自己多層化細胞シートの構造的・機能的特性とその分子メカニズムの解明を進める。多層構造を有する新規細胞シートは、従来の細胞シート技術で作製される単層シートと比較して高い機械的強度を備えているので、これを実証する方法として材料工学的手法による力学的特性の定量評価をさらに継続する。また、細胞の自己多層化を制御する内因性シグナルの解析を通じて、この現象の分子細胞生物学的基盤を明らかにし、Reg細胞群の存在を特徴づける多層化誘導メカニズムを明らかにする。
これらの解析を強力に支援する装置として、昨年度からインキュベーションモニタリングシステムの導入を検討している。これにより細胞増殖や多層化の過程をリアルタイムかつ連続的に撮影・記録することが可能となる。経時的な細胞挙動を可視化することで、自己多層化シートの形成過程を定量的に捉え、客観的な解析基盤を確立する。
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