超精密個別化ゲノム解析法の開発による遺伝性疾患の病因病態解明

• Project/Area Number: 23K21722
• Project/Area Number (Other): 21H03548 (2021-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2021-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 62010:Life, health and medical informatics-related
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 日笠 幸一郎 関西医科大学, 医学部, 教授 (10419583)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥16,900,000 (Direct Cost: ¥13,000,000、Indirect Cost: ¥3,900,000); Fiscal Year 2024: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000); Fiscal Year 2022: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2021: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
• Keywords: ヒトゲノム多様性 / ヒトゲノム構造多様性

Outline of Research at the Start

近年の遺伝性疾患の原因遺伝子診断率は30%程度であり、変異に応じた個別化医療を推進する上で、その改善が喫緊の課題となっている。本研究では、「高次構造型ヒトゲノム参照配列」の構築という課題に挑戦し、現行のヒトゲノム参照配列に基づく解析では検出が困難である病因変異の解明に貢献することを目指す。本研究の遂行により、現行の参照配列情報では捉えきれない未解決の遺伝性疾患症例を対象に原因遺伝子変異の同定が進み、遺伝子診断率の向上とゲノム情報に基づく個別化医療の進展に繋がることが期待される。

Outline of Annual Research Achievements

本年度も、ロングリード（長鎖）シークエンサーを用いて、高精度のヒトハプロイドゲノムを構築することを目的とし、２倍体ゲノムからの高分子DNAの抽出と解析を進めた。抽出法としてNanobindとpromega wizard kitを比較検討した。Nanobindでは、最頻値50kb強、平均40kbのDNAが約23ug、promegaでは、最頻値50kb弱、平均25kbのDNAが約10ug抽出され、Nanobindの方が、サイズ・収量ともに、良好な結果であった。Nanobindで抽出したDNA約7ugを使用してライブラリを作製し、Oxford Nanopore PromethIONを用いて、シークエンスを実施した。ライブラリ1は、総塩基数26.7Gb、リード数1.4M、N50=32.0kb、平均リード長18.8kb、ライブラリ2は、総塩基数41.1Gb、リード数5M、N50=16.6kb、平均リード長8.3kbであった。これらのシークエンスデータを用いてアセンブリーを実施し、コンティグN50=27.3Mb、最大値126.3Mb、平均4.1Mb、総塩基長が2.75Gbを得たことから、十分な質のDNAからシークエンスデータが得られていることが推察される。平均リード長が抽出したDNA断片長から期待される値よりも短い傾向があることから、NEB Monarch HMW DNA Extraction KitによるDNA抽出や、Ultra-Long DNA Sequencing Kit V14+R10.4 poreによるシークエンスの実施など、更なる検討を進める。日本人参照配列の高次元化に利用する全ゲノム情報については、解析が完了している3,000検体を約10,000検体まで拡充し、参照配列の構築に必要なゲノム上の構造変異情報の収集に努める。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、主に２倍体のDNAを用いてロングリードシークエンス解析を進めた。構築できた参照配列は、従来のヒトゲノム参照配列と比して遜色ないことから、当該データについてはHaplotype aware assemblyを実施し、ハプロタイプの構築精度の評価が可能である。高次元化に利用する全ゲノム情報についても拡充の目処がたち、日本人参照配列の構築に向けて順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

本年度は、２種類の高分子DNA抽出法と、Nanoporeシークエンサーを用いたロングリードシークエンス解析を進め、de novo assemblyによって日本人ゲノム配列を構築した。当該データについては更なる分析を進めると共に、更に高分子のDNAを抽出するプロトコルや改良された長鎖シークエンスkitの採用、PacBioの高品質長鎖配列の追加も検討し、精度の高い日本人参照配列の構築を目指す方針とする。また、日本人ゲノムの網羅性を高めるため、全ゲノム解析対象検体を1万検体まで追加し、解析する予定である。日本人由来ではないが、T2Tコンソーシアムから昨年4月に公開された最新のヒトゲノム参照配列との比較検討も今後の課題である。

Research Products

• [Journal Article] Successful pregnancy and delivery in a young-onset hypertrophic cardiomyopathy patient with a novel doublet-base substitution in the MYH7 gene (2023)
  • Author(s): Miyawaki Norihisa、Toyota Toshiaki、Higasa Koichiro、Nakamura Tomoyuki、Furukawa Yutaka
  • Journal Title: Journal of Cardiology Cases Volume: 27 Issue: 1 Pages: 8-11
  • DOI: 10.1016/j.jccase.2022.09.010
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Deep learning-based predictions of clear and eosinophilic phenotypes in clear cell renal cell carcinoma (2023)
  • Author(s): Ohe C, Yoshida T, Amin MB, Uno R, Atsumi N, Yasukochi Y, Ikeda J, Nakamoto T, Noda Y, Kinoshita H, Tsuta K, Higasa K.
  • Journal Title: Human Pathology Volume: 131 Pages: 68-78
  • DOI: 10.1016/j.humpath.2022.11.004
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Areas of Crush Nuclear Streaming Should Be Included as Tumor Content in the Era of Molecular Diagnostics (2023)
  • Author(s): Noda Yuri、Yamaka Ryosuke、Atsumi Naho、Higasa Koichiro、Tsuta Koji
  • Journal Title: Cancers Volume: 15 Issue: 6 Pages: 1910-1910
  • DOI: 10.3390/cancers15061910
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Multiple Pre-Treatment miRNAs Levels in Untreated Major Depressive Disorder Patients Predict Early Response to Antidepressants and Interact with Key Pathways. (2022)
  • Author(s): Kato M, Ogata H, Tahara H, Shimamoto A, Takekita Y, Koshikawa Y, Nishida K, Nonen S, Higasa K, Kinoshita T.
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences. Volume: 23 Issue: 7 Pages: 3873-3873
  • DOI: 10.3390/ijms23073873
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Accelerated Angiogenesis of Human Umbilical Vein Endothelial Cells Under Negative Pressure Was Associated With the Regulation of Gene Expression Involved in the Proliferation and Migration (2022)
  • Author(s): Fukui Michika、Matsuoka Yuki、Taketani Shigeru、Higasa Koichiro、Hihara Masakatsu、Kuro Atsuyuki、Kakudo Natsuko
  • Journal Title: Annals of Plastic Surgery Volume: 89 Issue: 6 Pages: e51-e59
  • DOI: 10.1097/sap.0000000000003298
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Multidimensional analyses of the pathomechanism caused by the non-catalytic GNE variant, c.620A>T, in patients with GNE myopathy (2022)
  • Author(s): Yoshioka Wakako、Iida Aritoshi、Sonehara Kyuto、Yamamoto Kazuki、Oya Yasushi、Mori-Yoshimura Madoka、Kurashige Takashi、Okubo Mariko、Ogawa Megumu、Matsuda Fumihiko、Higasa Koichiro、Hayashi Shinichiro、Nakamura Harumasa、Sekijima Masakazu、Okada Yukinori、Noguchi Satoru、Nishino Ichizo
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 21806-21806
  • DOI: 10.1038/s41598-022-26419-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Histologic-based tumor-associated immune cells status in clear cell renal cell carcinoma correlates with gene signatures related to cancer immunity and clinical outcomes (2022)
  • Author(s): Ohe C, Yoshida T, Ikeda J, Tsuzuki T, Ohashi R, Ohsugi H, Atsumi N, Yamaka R, Saito R, Yasukochi Y, Higasa K, Kinoshita H and Tsuta K.
  • Journal Title: Biomedicines Volume: 10 Issue: 2 Pages: 323-323
  • DOI: 10.3390/biomedicines10020323
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] PBRM1 Immunohistochemical Expression Profile Correlates with Histomorphological Features and Endothelial Expression of Tumor Vasculature for Clear Cell Renal Cell Carcinoma (2022)
  • Author(s): Saiga K*, Ohe C* (*equally contributed), Yoshida T, Ohsugi H, Ikeda J, Atsumi N, Noda Y, Yasukochi Y, Higasa K, Taniguchi H, Kinoshita H, Tsuta K.
  • Journal Title: Cancers (Basel) Volume: 14 Issue: 4 Pages: 1062-1062
  • DOI: 10.3390/cancers14041062
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Development and validation of a vascularity-based architectural classification for clear cell renal cell carcinoma: correlation with conventional pathological prognostic factors, gene expression patterns, and clinical outcomes (2021)
  • Author(s): Ohe C, Yoshida T, Amin MB, Atsumi N, Ikeda J, Saiga K, Noda Y, Yasukochi Y, Ohashi R, Ohsugi H, Higasa K, Kinoshita H and Tsuta K
  • Journal Title: Mod Pathol Volume: － Issue: 6 Pages: 816-824
  • DOI: 10.1038/s41379-021-00982-9
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genotype-Phenotype Correlations in RP1-Associated Retinal Dystrophies: A Multi-Center Cohort Study in JAPAN (2021)
  • Author(s): Mizobuchi Kei、Hayashi Takaaki、Oishi Noriko、Kubota Daiki、Kameya Shuhei、Higasa Koichiro、Futami Takuma、Kondo Hiroyuki、Hosono Katsuhiro、Kurata Kentaro、Hotta Yoshihiro、Yoshitake Kazutoshi、Iwata Takeshi、Matsuura Tomokazu、Nakano Tadashi
  • Journal Title: Journal of Clinical Medicine Volume: 10 Issue: 11 Pages: 2265-2265
  • DOI: 10.3390/jcm10112265
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Eosinophilic features in clear cell renal cell carcinoma correlate with outcomes of immune checkpoint and angiogenesis blockade (2021)
  • Author(s): Yoshida T, Ohe C, Ikeda J, Atsumi N, Ohsugi H, Sugi M, Higasa K, Saito R, Tsuta K, Matsuda T, Kinoshita H.
  • Journal Title: J Immunother Cancer . Volume: 9 Issue: 9 Pages: e002922-e002922
  • DOI: 10.1136/jitc-2021-002922
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Population dynamics in the Japanese Archipelago since the Pleistocene revealed by the complete mitochondrial genome sequences. (2021)
  • Author(s): Mizuno, F., Gojobori, J., Kumagai, M., Baba, H., Taniguchi, Y., Kondo, O., Matsushita, M., Matsushita, T., Matsuda, F., Higasa, K., Hayashi, M., Wang, L., Kurosaki, K. and Ueda, S.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Issue: 1 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1038/s41598-021-91357-2
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Thiazoline-related innate fear stimuli orchestrate hypothermia and anti-hypoxia via sensory TRPA1 activation (2021)
  • Author(s): Matsuo Tomohiko、Isosaka Tomoko、Hayashi Yuichiro、Tang Lijun、Doi Akihiro、Yasuda Aiko、Hayashi Mikio、Lee Chia-Ying、Cao Liqin、Kutsuna Natsumaro、Matsunaga Sachihiro、Matsuda Takeshi、Yao Ikuko、Setou Mitsuyoshi、Kanagawa Dai、Higasa Koichiro、Ikawa Masahito、Liu Qinghua、Kobayakawa Reiko、Kobayakawa Ko
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 12 Issue: 1 Pages: 2074-2074
  • DOI: 10.1038/s41467-021-22205-0
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Combined Single Nucleotide Variants of ORAI1 and BLK in a Child with Refractory Kawasaki Disease (2021)
  • Author(s): Kanda Saki、Fujii Yoshimitsu、Hori Shin-ichiro、Ohmachi Taichi、Yoshimura Ken、Higasa Koichiro、Kaneko Kazunari
  • Journal Title: Children Volume: 8 Issue: 6 Pages: 433-433
  • DOI: 10.3390/children8060433
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] PDK2 leads to cisplatin resistance through suppression of mitochondrial function in ovarian clear cell carcinoma (2021)
  • Author(s): Kitamura S, Yamaguchi K, Murakami R, Furutake Y, Higasa K, Abiko K, Hamanishi J, Baba T, Matsumura N, Mandai M.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 112 Issue: 11 Pages: 4627-4640
  • DOI: 10.1111/cas.15125
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Positive renal familial history in IgA nephropathy is associated with worse renal outcomes: a single-center longitudinal study (2021)
  • Author(s): Sato Yoshinori、Tsukaguchi Hiroyasu、Higasa Koichiro、Kawata Naoto、Inui Kiyoko、Linh Tran Nguyen Truc、Quynh Tran Thuy Huong、Yoshihiko Inoue、Koiwa Fumihiko、Yoshimura Ashio
  • Journal Title: BMC Nephrology Volume: 22 Issue: 1 Pages: 490-502
  • DOI: 10.1186/s12882-021-02425-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genome-wide association study of individual differences of human lymphocyte profiles using large-scale cytometry data (2020)
  • Author(s): Okada Daigo、Nakamura Naotoshi、Setoh Kazuya、Kawaguchi Takahisa、Higasa Koichiro、Tabara Yasuharu、Matsuda Fumihiko、Yamada Ryo
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 66 Issue: 6 Pages: 557-567
  • DOI: 10.1038/s10038-020-00874-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] マウス脊髄損傷へのイモリ型脊髄再生原理の導入へ向けて (2023)
  • Author(s): 林真一、関亮平、大江総一、小池太郎、中野洋輔、伊藤健、安河内彦輝、日笠幸一郎、北田容章
  • Organizer: 両生類研究センターバイオリソース棟落成記念シンポジウム
• [Presentation] マウス脊髄損傷へのイモリ型脊髄再生原理の導入へ向けて (2023)
  • Author(s): 林真一、関亮平、大江総一、小池太郎、中野洋輔、伊藤健、安河内彦輝、日笠 幸一郎、北田容章
  • Organizer: 日本解剖学会総会・全国学術集会
• [Presentation] マウス脊髄損傷へのイモリ型脊髄再生原理の導入へ向けて (2023)
  • Author(s): 林真一、関亮平、大江総一、小池太郎、中野洋輔、伊藤健、安河内彦輝、日笠幸一郎、北田容章
  • Organizer: 日本再生医療学会総会
• [Presentation] Multi-dimensional analyses of the pathomechanism of GNE myopathy with non-catalytic site variant, GNE: c.620A>T (2022)
  • Author(s): Wakako Yoshioka, Aritoshi Iida, Kyuto Sonehara, Kazuki Yamamoto, Yasushi Oya, Madoka Mori-Yoshimura, Takashi Kurashige, Mariko Okubo, Megumu Ogawa, Fumihiko Matsuda, Koichiro Higasa, Shinichiro Hayashi, Harumasa Nakamura, Masakazu Sekijima, Yukinori Okada, Satoru Noguchi, Ichizo Nishino
  • Organizer: Myology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Gut microbiota as a factor underlying Kawasaki disease susceptibility (2022)
  • Author(s): Yoshiki Teramoto , Shohei Akagawa , Yuko Akagawa , Shin-ichiro Hori , Sohsaku Yamanouchi , Shoji Tsuji , Koichiro Higasa , Kazunari Kaneko
  • Organizer: International Human Microbiome Consortium 9thCongress
• [Presentation] 本邦のうつ病患者における疾患発症、重症度、薬物治療反応性に関するゲノムワイド関連解析（GWAS) (2022)
  • Author(s): 島本優太郎, 安河内彦輝, 村瀬雄士, 越川陽介, 舩槻紀也, 緒方治彦, 嶽北佳輝, 木下利彦, 日笠幸一郎, 加藤正樹
  • Organizer: BPCNPNPPP4学会合同年会
• [Presentation] 本邦のうつ病患者における疾患発症、薬物治療反応性に関するゲノムワイド関連解析（GWAS) (2022)
  • Author(s): 島本優太郎, 安河内彦輝, 村瀬雄士, 越川陽介, 舩槻紀也, 緒方治彦, 嶽北佳輝, 木下利彦, 日笠幸一郎, 加藤正樹
  • Organizer: 第41回躁うつ病の薬理・生化学的研究懇話会
• [Presentation] 本邦のうつ病患者と健常者サンプルを用いたゲノムワイド関連解析（GWAS） (2022)
  • Author(s): 島本優太郎, 安河内彦輝, 村瀬雄士, 越川陽介, 舩槻紀也, 緒方治彦, 木下利彦, 日笠幸一郎, 加藤正樹
  • Organizer: 第19回日本うつ病学会総会／第5回日本うつ病リワーク協会年次大会【合同開催】
• [Presentation] 日本人におけるRP1関連網膜症の遺伝的、臨床的特徴について (2021)
  • Author(s): 溝渕圭、林孝彰、林孝彰、大石典子、亀谷修平、日笠幸一郎、二見拓磨、近藤寛之、細野克博、倉田健太郎、堀田喜裕、吉武和敏、岩田岳、中野匡
  • Organizer: 第125回日本眼科学会
• [Presentation] Novel double missense mutation at the same codon in the MYH7 gene in a patient with hypertrophic cardiomyopathy. (2021)
  • Author(s): Miyawaki N, Toyota T, Kim K, Kitai T, Kaji S, Higasa K, Nakamura T, Furukawa Y.
  • Organizer: European Society of Cardiology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] GNE pathogenic variant p.D207V rarely develops myopathy in homozygote (2021)
  • Author(s): Yoshioka W, Sonehara K, Iida A, Oya Y, Kurashige T, Okubo M, Ogawa M, Matsuda F, Higasa K, Mori-Yoshimura M, Nakamura H, Hayashi S, Okada Y, Noguchi S, Nishino I.
  • Organizer: World Muscle Society
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 陰圧が血管内皮細胞（HUVEC）に与える影響：次世代シーケンサーを用いた遺伝子発現の網羅的解析 (2021)
  • Author(s): 福井充香、日笠幸一郎、竹谷茂、光井俊人、松岡祐貴、日原正勝、孫仲鑫、覚道奈津子
  • Organizer: 第30回日本形成外科学会基礎学術集会
• [Book] 遺伝子医学 (2022)
  • Author(s): 日笠幸一郎
  • Total Pages: 6
  • Publisher: メディカルドゥ
  • ISBN: 9784909508171
• [Remarks] 世界で初めて網羅的にmiRNAを解析し抗うつ薬の予測に有用であることを示す
  • URL: https://www.kmu.ac.jp/news/laaes7000000kr5t-att/20220518Press_Release.pdf
• [Remarks] 淡明細胞型腎細胞癌の形態を解明、新分類法確立
  • URL: https://www.kmu.ac.jp/news/laaes7000000hz09-att/20211022Press_Release.pdf