Development of nuclear DNA markers and long-read sequencing methods for environmental DNA
| Project/Area Number |
23K21776
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| Project/Area Number (Other) |
21H03654 (2021-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2021-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 64040:Social-ecological systems-related
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| Research Institution | Osaka Ohtani University |
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Principal Investigator |
内井 喜美子 大阪大谷大学, 薬学部, 准教授 (90469619)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
見坂 武彦 摂南大学, 理工学部, 教授 (80397661)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2021: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
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| Keywords | 長鎖配列解析 / 環境DNA / 核DNAマーカー / 種内変異 / 長鎖塩基配列解析 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、個体群遺伝構造・遺伝的多様性を評価する手法としての環境DNA分析の機能拡張を目的とし、核rRNAをマーカーとする個体群遺伝構造・遺伝的多様性解析法の確立を行う。同時に、ナノポアシーケンサーを用いた長鎖塩基配列解析法を環境DNA分析に適用し、従来の環境DNA分析では困難であった遺伝的多様性が低い集団の個体群遺伝構造・遺伝的多様性解析を実現することを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
環境DNA研究において、検出対象を種から種内変異へと拡張する動きが活発となっている。しかし、現状のアプローチ法にはいくつかの制約がある。まず、環境DNA分析で用いられる主要なDNAマーカーはミトコンドリアDNAマーカーである。しかしミトコンドリアDNAは母性遺伝をするため、個体群の遺伝構造や遺伝的多様性を評価する上で情報量が少ない。また、環境DNAメタバーコーディングは大量の塩基配列を一挙に解読できる点において種内変異解析に有用な手法であるが、主流となっている超並列シーケンサーでは数百塩基対という短いDNA配列の解析しかできず、遺伝変異に乏しい種や集団の種内多型の検出が難しい。このような制約を克服するため、核rRNA遺伝子領域における多型マーカーの開発による雌雄の情報を反映する遺伝構造解析法の確立と、環境DNA分析への長鎖配列解析法の適用を目指し、研究を進めた。2022年度までに、琵琶湖に生息するコイ科魚類を中心として、核DNAのrRNA遺伝子の18S rRNAから28S rRNAにまたがる領域のリファレンス配列を取得した。これらの配列を元に、日本在来系統と国外より持ち込まれた外来系統の交雑が進むコイ(Cyprinus carpio)個体群をモデルとし、両者を区別する核DNAマーカーを開発した。次に、本マーカーを用い、コイの地域個体群の遺伝構造を推定するための、超並列シーケンサーによる環境DNAメタバーコーディング法の開発を行った。さらに、琵琶湖のコイの地域個体群における遺伝構造を評価するため、湖一円のコイ繁殖生息地において環境DNA試料の採取を進めた。長鎖配列解析においては、2022年度までの検証により、読み取り精度の低さから改善が必要であったナノポアシーケンサーについて、新規試薬を使用することによる精度の改善が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
核rDNAマーカーの開発とそれを用いた環境DNAメタバーコーディングにより、交雑個体群の遺伝構造を評価する手法を既に開発し、野外適用を進めつつある。予備的検証からは、従来のミトコンドリアDNAマーカーに比べ、核rDNAマーカーは同一環境DNA試料を用いた場合の検出効率が高く、雌雄ともの情報を反映する点からも環境DNA分析で用いる種内多型マーカーとして非常に有用であることを見出した。ナノポアシーケンサーを用いた環境DNA分析への長鎖配列解析法の適用は、まだ実践には至っていないが、技術的な制約であった塩基読み取り精度の低さは新規試薬の登場により改善された。2023年度以降、新規試薬を用いることにより、研究の進展が期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度は、琵琶湖一円のコイ繁殖生息地で収集した環境DNA試料を用い、開発した核rDNAマーカーによる環境DNAメタバーコーディング解析を進め、コイ交雑個体群の遺伝構造評価を進める。また長鎖配列解析においては、2022年度までの検証により、読み取り精度の低さから改善が必要であったナノポアシーケンサーについて、新規試薬を使用することにより精度の改善が認められたため、2023年度は、まずは飼育水等の単純な系を用いることにより、環境DNAへの適用可能性について検証を進める。
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Report
(2 results)
Research Products
(5 results)
