| Project/Area Number |
23K23147
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| Project/Area Number (Other) |
22H01879 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松田 史生 大阪大学, 大学院情報科学研究科, 教授 (50462734)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡橋 伸幸 大阪大学, 大学院情報科学研究科, 准教授 (30802748)
清家 泰介 大阪大学, 大学院情報科学研究科, 助教 (80760842)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
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| Keywords | 代謝工学 / 出芽酵母 / アルコール生産 / 代謝シミュレーション / オミクス解析 / エタノール / メタボローム / プロテオーム / 代謝フラックス解析 |
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| Outline of Research at the Start |
代謝工学による細胞内代謝経路のファインチューニングに必要な、出芽酵母中心代謝シミュレーターを構築する新手法を開発する。合理的な代謝設計により、バイオアルコール生産出芽酵母のもともと高い比生産速度を極限まで向上させることを目指す。アンサンブル機械学習法を用いて予測力を向上させる。これらを組み合わせたデータ駆動型のアンサンブル機械学習法で、従来法では困難だったバイオアルコール生産速度を予測可能な代謝シミュレーターを開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに多階層オミクスデータを訓練データとして、50反応からなる中心代謝速度論モデルのパラメータを学習させたシミュレーター ver 1を構築してきた。これを用い、出芽酵母実験室株の各代謝酵素の発現量を増減させた時のエタノール生産速度を予測した。本手法は、単独で使うと精度の低い予測モデルを多数用いることで予測の汎化性能を向上させ、予測結果のばらつきから予測精度を評価可能できる点に特徴がある。今回は、2100個のモデルの集団（アンサンブル）を用い、すべてのモデルである酵素の存在量を増加させたときのエタノール生産速度を予測させた。200個の予測値の中央値、９５％信頼区間から、発現量の変化がエタノール生産速度向上に寄与する酵素を探索した。その結果をエタノール生産能の高い醸造用酵母の代謝フラックス解析結果と合わせて解析し、ATPの消費の向上がエタノール生産向上に寄与すると推測した。そこで、実験室株を宿主として、ATP消費反応である、FBPaseやATPaseの過剰生産株を構築した結果、エタノール生産速度を45%向上させることに成功した。
さらにシミュレーター ver 1をもとにグルコーストランスポーターを加味する改良を試みた。これまでに取得した多階層データを学習データとして用い、細胞内代謝物からのアロステリック制御の有り無しもパラメータとした様々なモデルを順列組み合わせ的に発生し、再現性もよいモデルを探索した。
また、出芽酵母の比増殖速度は、培地条件（合成培地や天然培地）によって大きく影響を受ける。そこで、13C-代謝フラックス解析法を改良し、天然培地でも適用可能とした。異なる培地条件や、培養フェイズにある実験室株(S288C)から、代謝計測データを取得した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
出芽酵母代謝シミュレーターを構築するには、細胞内代謝流束を測定し、反応速度論や熱力学に立脚した解析をすることが求められる。細胞内代謝流束を測定する手法の１つとして、13C代謝フラックス解析(13C-MFA)がある。そこで、エタノール比生産速度が高い出芽酵母2倍体実用株（実験室株: BY4947、ワイン株: QA23、パン株: RedStar、清酒株: Kyokai 7）を合成培地中、好気条件下で回分培養し、13C-MFAで代謝フラックス分布を推定した。その結果、実用株はいずれもTCA回路のフラックス値が実験室株より高くなる傾向があった。また代謝フラックス分布から算出したATP消費速度は、実用株が実験室株より高くなっていた。これらの知見と代謝シミュレーターの予測結果を組み合わせ、ATP消費量の増加が、エタノール生産性向上に寄与すると推定した。そこで、出芽酵母野生株に大腸菌由来のATPaseを導入してATPを人為的に浪費させたところ、エタノール生産速度を45%上昇させることに成功した。また、13C-MFAでは、炭素源から13C標識を追跡するために合成培地で培養された出芽酵母を対象にしてきた。一方、天然培地での培養時にはエタノール生産速度が向上することが知られており、そのメカニズムの解明は代謝シミュレーターの開発にも有用である。そこで、出芽酵母中心代謝ネットワークの代謝フラックス測定するために、天然培地で培養した出芽酵母への13C-MFAの適用を試みた。まず、出芽酵母実験室株を20種類のアミノ酸を添加したSD培地(SD-AA)およびYPD培地で培養した。パラレルラベリングや他の炭素源の取り込み速度の測定によって、SD-AAおよびYPD培地で増殖した出芽酵母の13C-MFAに成功した。このように計画通り成果がでていることから、「（２）おおむね順調に推移している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題2グルコース取り込み速度を予測可能な出芽酵母代謝シミュレーター ver 2の構築
２０２４年度は、２０２３年度に構築したシミュレーター ver ２のさらなる予測精度向上を行い、これを用いてグルコース取り込み比速度向上を通じてエタノールと2,3BDO生産速度を向上させる代謝反応を特定する。作成した代謝設計をもとに出芽酵母実験室株、および2,3BDO生産株に改変を加え、生産速度5%アップを実現する。2,3BDO生産株は過去に作成したものを用いる
課題3 有用物質生産速度を高精度に予測可能な出芽酵母代謝シミュレーター ver 3の構築（2023-2025年度、松田、岡橋、清家）
2024年度は、2023年度までに実施した天然培地で適用な能な13C-代謝フラックス解析法を用いて、異なる培地条件や、培養フェイズにある実験室株(S288C)から取得した代謝計測データを用い、さらに、中心代謝速度論モデルを改良し、アミノ酸生合成経路を追加し、比増殖速度の予測にチャレンジする。これまでに得た多階層データを活用して、データ駆動型のアンサンブル機械学習を行う。困難な場合は、含硫黄アミノ酸生合成経路など産業上重要な経路に絞り込む。
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