| Project/Area Number |
23K23151
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| Project/Area Number (Other) |
22H01883 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
和泉 自泰 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (70622166)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
相馬 悠希 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80781955)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
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| Keywords | メタボローム解析 / 機能的遺伝学 / ビッグデータ / 大腸菌 / ノンターゲットメタボロミクス / 構造推定 / エピメタボライト |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、次世代メタボローム解析技術を用いて、代謝マップの拡張および機能未知酵素遺伝子の包括的帰属に挑戦する。具体的には、「課題①：エピメタボライトライブラリーの構築と代謝マップの拡張」、「課題②：3960種の大腸菌単一遺伝子破壊株（Keio collection）の網羅的定量メタボローム分析」、「課題③：大腸菌の機能未知酵素遺伝子の包括的帰属」、の3つの研究課題に取り組む。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、「①エピメタボライトライブラリーの構築と代謝マップの拡張」および「②3960種の大腸菌単一遺伝子破壊株の網羅的定量メタボローム分析」の課題に取り組んだ。
課題①では、昨年、我々が開発した幅広い親水性代謝物を網羅的かつ一斉に分離検出できる親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィー高分解能タンデム質量分析（unified-HILIC/AEX/HRMS/MS）の保持時間予測モデルの開発を行った。トレーニングデータ（203種類の極性代謝物）とその分子記述子（12,420種類）に対し、ランダムフォレストを用いて特徴量重要度をランク付けした。特徴量重要度に基づいて選出した26種類の分子記述子を用いて保持時間予測モデルを構築した。当該保持時間予測モデルを活用することで、大腸菌由来エピメタボライト候補の絞り込みが可能となった。最終的に、（1）各種細胞の安定同位体in vivoラベリング（13Cグルコース、15N基質）、（2）Unified HILIC/AEX/HRMS/MSによるメタボローム測定、（3）非標識体および標識体由来のペアードピークフィルタリングおよび13C、15N情報を活用した組成式推定、（4）in silico epimetabolite database IEMDB（HRMSおよびHRMS/MS）および開発した保持時間予測モデルを用いて、ピーク同定および構造の帰属を行うことで、106種の代謝物の同定に加えて、90種のエピメタボライトの構造推定に成功した。現在、90種のエピメタボライト候補の中から化学合成可能な標準品を選定し、同定作業を進めている。
課題②では、昨年度までに研究分担者である相馬が中心となり開発した「96-wellプレートを使用した細胞培養および高速・高精度のサンプル調製法」を用いて3960種の大腸菌のデータ取得に着手した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
課題①の「エピメタボライトライブラリーの構築と代謝マップの拡張」については、（1）各種細胞の安定同位体in vivoラベリング（13Cグルコース、15N基質）、（2）Unified HILIC/AEX/HRMS/MSによるメタボローム測定、（3）非標識体および標識体由来のペアードピークフィルタリングおよび13C、15N情報を活用した組成式推定、（4）IEMDB（HRMSおよびHRMS/MS）によるピーク同定および構造の帰属、の研究計画に従い、大腸菌抽出液から90種類の親水性エピメタボライトの帰属に成功した。また、昨年、我々が考案したUnified HILIC/AEX/HRMS/MSによる新規のメタボローム分析法で取得した大腸菌代謝物ピークに対して構造アノテーションの精度を向上させるために、保持時間予測モデルを構築した。本研究成果は、分析化学の専門誌であるAnalytical Chemistryに受理され高い評価を得た。さらに、親水性代謝物の包括的分析法であるUnified HILIC/AEX/HRMS/MSを拡張し、親水性から疎水性に至る超網羅的な代謝物を一斉に測定可能な分析系へと発展させた。
また、課題②の「3960種の大腸菌単一遺伝子破壊株の網羅的定量メタボローム分析」においては、プレートの種類や植菌法、前培養・本培養の時間や播種量を最適化し、大腸菌がもつ親水性から脂質までの幅広い代謝物を包括的かつ効率的に抽出するための溶媒および前処理条件の最適化を行い、3960種の大腸菌のデータ取得に着手した。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題①の「エピメタボライトライブラリーの構築と代謝マップの拡張」については、引き続き、Unified HILIC/AEX/HRMS/MS分析法およびIEMDBを用いて大腸菌に含まれる未知の代謝物の帰属を進める。課題②の「3960種の大腸菌単一遺伝子破壊株の網羅的定量メタボローム分析」については、相馬らと連携しながら3960種の大腸菌のデータ取得を完了させる。課題③の「大腸菌の機能未知酵素遺伝子の包括的帰属」については、3960種の大腸菌KO株のノンターゲットメタボロームデータの中からIEMDBを用いて、エピメタボライトの帰属を網羅的に実施する。また、各遺伝子のKOによって存在量が大きく変動したエピメタボライトを探索し、KO遺伝子との関係性を多角的に考察しながら、大腸菌の機能未知酵素遺伝子候補の絞り込みを行う。
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