Platform for analysis of biological vesicle contents by fusion with membranes suspended over microwells
| Project/Area Number |
23K23188
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| Project/Area Number (Other) |
22H01920 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 28040:Nanobioscience-related
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
住友 弘二 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (30393747)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山口 明啓 東洋大学, 理工学部, 教授 (70423035)
湊元 幹太 三重大学, 工学研究科, 教授 (80362359)
部家 彰 兵庫県立大学, 工学研究科, 准教授 (80418871)
大嶋 梓 日本電信電話株式会社NTT物性科学基礎研究所, 多元マテリアル創造科学研究部, 主任研究員 (90751719)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000)
Fiscal Year 2025: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
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| Keywords | 人工生体膜 / ベシクル融合 / 表面増強ラマン / 膜電位 / 膜融合 / 表面増強ラマン散乱 / エンベロープウイルス / イオン透過 |
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| Outline of Research at the Start |
生体内での物質輸送機構を，半導体基板上マイクロウエルを用いて再構築し，ウイルスやエクソソームを始めとする細胞外小胞内容物を高感度に検出可能な人工細胞膜マイクロウエル型バイオセンサーを構築する．
そのために，[A]マイクロウエル架橋膜の機能化を行うことで生物小胞を選択的融合機能で識別するバイオインターフェースを構築し，生物小胞内容物をマイクロウエル内に取り込む．さらに，[B]ウエル内腔に取り込んだタンパク質や核酸（DNA／RNA）を基質とする微小反応場と高感度検出機構を構築する事で，単一分子レベルの生物小胞内容物検出を目指す．
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| Outline of Annual Research Achievements |
「架橋膜の機能化とベシクル融合の評価」として，架橋膜にビオチン化脂質で修飾をすることで，ビオチン/アビジン結合を用いたベシクルの結合を行った．架橋膜にベシクルをつなぎとめることで，高効率な融合を目指した．溶液中にCa2+イオンを追加することで融合のトリガーとして働くことを明らかにした．また，過剰なビオチン/アビジン結合が融合阻害に働くことも発見し，ビオチン/アビジン結合濃度の最適化を行った．
「ベシクル内容物のマイクロウエル内への移動」として，高濃度の蛍光色素（カルセイン）内包ベシクルをマイクロウエル架橋膜につなぎ止め，その融合制御することでカルセインのマイクロウエル内への移動を計測した．一部，蛍光色素の移動の可能性は示せたものの，その効率は十分ではなく，内容物解析のためにはさらなる融合促進が必要であることが分かった．
「金ナノ粒子のマイクロウエル内封入」に関しては，封入した金ナノ粒子の凝集を制御することを試みた．まずは，巨大ベシクル（GUV）を反応場として用いるべく，その内部への金ナノ粒子の封入を行った．油水界面通過法でGUVを形成することで，内部への金ナノコロイドの封入を確認した．GUVに，1価のカチオンを透過させるグラミシジンを導入し，GUV内イオン濃度の制御を試みた．また，プロトンの脂質膜透過も定量的に評価し，膜電位の発生も確認した．
上記の成果については，国際会議IVC-22，応用物理学会2022年秋季後援会，応用物理学会2023年春季後援会で発表した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究を実施するうえでキーとなる，マイクロウエル架橋膜の機能化に関して，概ね当初の予定通りの進展を見せている．ビオチン化脂質で修飾することで，ビオチン/アビジン結合を用いたベシクルの捕捉，選択的配置に成功している．2価イオンの導入をトリガーとしたベシクル融合も実現している．
ベシクル内外にイオン濃度差をつけた場合，プロトンおよびOH-イオンの透過を定量的に評価した．イオンチャネルを含まない場合でも，比較的高い透過係数を有し，これらのイオン透過により膜電位を制御できることを示した．1価のカチオンを透過するグラミシジンの導入と組み合わせて，イオン透過や膜電位を制御できる．これらの知見は，内包した金ナノ粒子の凝集制御や，小胞体融合制御に重要な役割を果たすと考える．
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| Strategy for Future Research Activity |
「架橋膜の機能化とベシクル融合の評価」として架橋膜につなぎ留めたベシクルの融合制御をさらに進める．融合過程の動的観察を実施し，融合メカニズムの理解を深め，融合促進因子の探索を行う．融合効率の上昇，融合サイトの制御を目指す．
「ベシクル内容物のマイクロウエル内への移動」として，現状ではその効率が不十分である．今後，融合促進因子の探索を行い，融合効率，物質移動効率の向上を目指す．周辺イオン種と濃度の最適化，脂質分子（電荷，分子構造）依存性の検討，外部駆動力（浸透圧，電位変化）の付与等を検討する．
「金ナノ粒子のマイクロウエル内封入」に関しては，巨大ベシクル（GUV）内への金ナノ粒子の封入および，その凝集制御を行う．GUVへのイオンチャネルの導入，イオン透過の制御を元に，GUV内での金ナノ粒子の凝集制御を行うとともに，その表面増強ラマン計測を行う．増強効率の向上を図り，低濃度の内包生体分子の検出を目指す．これらの知見を元に，マイクロウエル内への金ナノ粒子の封入，凝集制御を行う．マイクロウエル外（基板表面）への意図しない金ナノ粒子の吸着を抑制し，高効率化を行う．
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Report
(1 results)
Research Products
(8 results)
