| Project/Area Number |
23K23463
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| Project/Area Number (Other) |
22H02196 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37010:Bio-related chemistry
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
伊藤 幸成 大阪大学, 大学院理学研究科, 招へい教授 (80168385)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松尾 一郎 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (40342852)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000)
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| Keywords | 複合糖質 / 小胞体 / グルコシル化 / 糖タンパク質 / 糖脂質 / 阻害剤 / アゴニスト / フォールディング / GPR55 |
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| Outline of Research at the Start |
複合糖質糖鎖の複雑さと多様性は，タンパク質や脂質に対して様々な酵素が様々なタイミングで作用することで生み出される．その中で、特に興味深いものに、グルコース転移酵素 (UGGT) がフォールディングセンサーとして機能する糖タンパク質フォールディングサイクルがある。本研究では、UGGTの機能を制御する分子を開発する。
一方，グルコースが結合したホスファチジルグルコシド (PtdGlc)から生成するリゾ体 (LysoPG) がG-タンパク共役型受容体GPR55の内在性アゴニストであることに着目し、その類縁体を系統的に合成し、新たなGPR55の制御分子を見出すともに新たな共有結合型阻害剤の開発を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
小胞体内糖タンパク質フォールディングに関与するグルコース転移酵素（UGGT）に対する阻害剤の開発を目指し，生成物阻害を起こすUDPのアナログを種々合成した．具体的には，UDPのαリン酸部分に対してスクアリル基をサロゲートに用いたアナログ（USQ）をデザインした．前年度の検討によりリボースの2’-位水酸基をアミノ基で置換することで阻害活性が著しく向上することが分かった．そこで今年度はウラシル部分に置換基を導入してその効果を見た．当初ウラシル部分の位置選択的トリアゾール化を経て4-位に置換基を導入することを試みたが，系統的な誘導体合成に適切な合成ルートの開発には至らなかった．そこで5-ブロモウリジンから合成したUSQ誘導体に種々のアミンを反応させて5-位置換体アナログの合成を行った．
GPR55を非可逆的に阻害する物質の創製を目指し，リソホスファチジルグルコシド（LysoPG）の新規なアナログをデザインした．求核性アミノ酸残基と反応するスクアリルチオエステル基を導入した化合物がLysoPGのアゴニスト活性を非可逆的に阻害することを踏まえ，硫黄原子の位置を変えたスクアリルチオエステル型アナログを合成した．Turning assayの結果，これら位置異性体の間で大きな活性の違いが見られた．
糖を含むリン酸化脂質の合成は工程の複雑さと中間体の精製がネックになっていた．そこで天然型LysoPGの効率的合成に向けて，固相担体を用いた手法を検討した．市販のオクタデシル基（C-18）を担持した樹脂にホスファチジン酸（PA）を吸着させた後，2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド（DMC）で活性化したグルコース誘導体を通液した．その後，樹脂を水で洗浄，メタノールで溶出することでLysoPGの前駆体となるPtdGlcが簡便に得られることを確認した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題の主要部分について以下の進捗があった．
(1)前年度見出したUGGTに対する阻害剤の活性を更に向上させるため，ウラシル部分5-位への置換基導入を行った．置換基としてBr， I， ヒドロキシエチルアミノ基，ベンジルアミノ基，ヒドロキシ基，ヒドロキシメチル基を導入した化合物の調整を達成した．それらの活性を比較したところ，5-位へのベンジルアミノ基導入によって活性の向上が見られた．これは置換基の塩基性あるいは芳香族性が寄与していることを示唆しており，今後の構造最適化に向けた有力な指針となるものである．
(2)以前にLysoPGのリン酸部分をスクアリル基に置換したアナログがGPR55に対するアゴニスト活性を示すことを見出していた．それを基に，スクアリル基部分が求核置換反応を行うように構造を修飾したスクアリルチオエステル新規型アナログを2種類合成しそれらの活性を比較したところ，硫黄原子が脂質部分に結合した位置異性体がより優れた活性を有し，GPR55を非可逆的に阻害するという結果が得られた．
(3)PtdGlc およびLysoPGの固相合成を目指し，フローマイクロリアクターを用いてDMCによるグルコースの活性化を行なった．反応液を連続的にカラムに供給できること，グルコース，DMCおよび塩基として用いるトリエチルアミンの混合比を流量によって制御することで反応条件を容易に変更できることを確認した．これにより，PtdGlcの迅速合成法を確立した．
以上の結果は，本課題の立案が妥当であり，および実施状況も良好であることを示している．主要な成果の論文化が年度内に完結しなかったので進捗としては「概ね順調」という自己評価に留めた．
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）UGGTの阻害剤に関しては，ウリジン部分の構造修飾を更に進めてより活性の強い化合物を探索する．具体的には，5-位に導入する置換基として適したものを探索する．それと共にトリアゾール化を経由した4-位への置換基導入を再度試みる．これらを通して修飾ウラシル構造の最適化を行ったうえで，リボース部位の2’-位がアミノ化と組み合わせることにより，高活性UGGT阻害剤を見出すことができると予想する．
（２）LysoPGアナログに関しては，我々が開発した化合物が実際にGPR55を非可逆的に阻害していることを示す結果が得られており，確実な証拠を固めた上で論文発表を行う．また，海外との共同研究で我々が開発したLysoPGアナログとGPR55との複合体のクライオ電顕による解析が進んでいる．その結果をもとにより活性の強い化合物のデザインを行う．
（３）超臨界クロマトシステムが結合したLCMSシステムを導入したため，PtdGlcのグルコースの1位の立体異性体の分離が可能となった．フローマイクロリアクターを用いて高い反応収率と立体選択性でPtdGlcが生成する条件を探索する．また，このグルコース1位へのリン酸基の導入反応を展開することで，種々のリン酸基含有生物活性物質を合成する手法としての一般性を高める．
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