| Project/Area Number |
23K23465
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| Project/Area Number (Other) |
22H02198 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37010:Bio-related chemistry
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
木村 哲就 神戸大学, 理学研究科, 准教授 (70506906)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,940,000 (Direct Cost: ¥13,800,000、Indirect Cost: ¥4,140,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
Fiscal Year 2022: ¥10,920,000 (Direct Cost: ¥8,400,000、Indirect Cost: ¥2,520,000)
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| Keywords | ABCトランスポーター / 分子分光学 / ヘム / 時間分解分光 / マイクロ流路デバイス / ナノディスク / 時間分解測定 / 分光法 / 分子輸送 / ATP / 時間分解計測 / 顕微分光法 |
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| Outline of Research at the Start |
ATPを利用して小分子を細胞膜で区切られた一方の空間から他方へと輸送する膜タンパク質であるABCトランスポーターについて、輸送基質をヘムとするABCトランスポーターを研究対象にすることによって輸送および構造ダイナミクスを可視化する。この測定は、マイクロ流路加工技術と最先端のレーザー分光・検出装置を組み合わせた汎用性の高い計測系によって実現する。その上で、複数の分子や 分子部分の構造的連動・化学反応の協奏・分子間相互作用によって「生体分子システムが実現する高次機能の分子機構解明」を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで界面活性剤を用いて可溶化したヘムABCトランスポーターBhuUVを用いて計測を行い、時間分解紫外/可視吸収分光、赤外吸収分光に成功している。しかし、輸送基質であるヘムと界面活性剤が非特異的に相互作用し、紫外/可視吸収スペクトルに特徴的なピークを示すため、バックグラウンドとしてスペクトルを歪ませてしまうことも見いだしている。そこで、本年度はBhuUVをナノディスク化あるいはamphipolによって可溶化することによって溶媒から界面活性剤を除去しBhuUV試料を用いて測定を行った。ナノディスク(nd-BhuUV), およびamphipol (amp-BhuUV) への再構成を行い、ヘムと界面活性剤の相互作用に由来するバックグラウンドの大幅な低減および、nd-BhuUV, あるいは amp-BhuUV とヘムとの相互作用をより特異的に観察できた。しかし、nd-BhuUVの収率が10% 程度と低いことや、amphipol再構成試料が沈殿を生じやすいことから、GDNへの再構成も行っている。
これらの測定は2022年度に引き続きヘム輸送ダイナミクスを紫外/可視吸収分光測定を中心に行った。研究代表者が平成25年度に構築したマイクロ秒の時間分解能をもつ自作の時間分解可視吸収スペクトル測定装置とマルチチャンネルCCD分光器によってS/Nを10倍以上高感度化し、精密計測を行った。また、2価および3価の鉄イオンを含有するヘムによって輸送に違いが起こるかどうかを確認する。特に還元型での計測を安定に行うために2022年度に導入した嫌気チャンバー内で光ファイバーを用いた小型分光器を用いて、時間分解測定を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画の通り、2022年度に成功したナノディスクおよびamphipol再構成型のABCトランスポーターを利用し、その分光測定を行うことができた。ただし、収量が想定以上に悪いことから、別の界面活性剤への可溶化が必要になったものの、cryoEM測定で実績のあるものを用いることで対応可能だと考えている。これらの試料を用いて、2024年度に種々の分光測定を推進できると考えられるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は ATPの結合・ 加水分解反応、ペリプラズムタンパク質(BhuT) とBhuUV の膜貫通ドメインの離合・集散、輸送基質であるヘムの受け渡し・輸送、核酸結合ドメインおよび膜貫通ドメインのコンフォメーション変化、という4つのダイナミクスの相関を明らかにすることを目的としたものである。2022/2023年度は上記のDDM再構成あるいは amphipol 再構成BhuUVを用いて、ヘム輸送ダイナミクスを、研究代表者が平成25年度に構築したマイクロ秒の時間分解能をもつ自作の時間分解可視吸収スペクトル測定装置を用いて精密計測を行うことに成功した。2024年度以降は2価および3価の鉄イオンを含有するヘムによって輸送に違いが起こるかどうかを確認するために、特に還元型での計測を安定に行う事のできる嫌気チャンバーにおける時間分解測定を行うためのコントロール実験を行なった。
また、BhuUVのATP結合あるいは加水分解反応に伴うコンフォメーション変化を測定するために、パルスESRを用いたスピンラベルESR測定を行う予定である。
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