| Project/Area Number |
23K23466
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| Project/Area Number (Other) |
22H02199 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37010:Bio-related chemistry
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
松浦 和則 鳥取大学, 工学研究科, 教授 (60283389)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐々木 善浩 京都大学, 工学研究科, 准教授 (90314541)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,320,000 (Direct Cost: ¥6,400,000、Indirect Cost: ¥1,920,000)
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| Keywords | ウイルスレプリカ / 生体内トラフィッキング / エンベロープ / ヘマグルチニン / 血液脳関門 / 核移行シグナル |
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| Outline of Research at the Start |
小胞やウイルスは、生体内で様々な化学的・物理的刺激に応じて時空間制御された多段階の物質移動：トラフィッキングしている。脳などの特定臓器・特定細胞・特定オルガネラへトラフィッキングする人工材料を構築できれば、革新的なドラッグデリバリー材料・分子ロボット技術として有用であるが、これまでそのようなウイルス模倣材料を創製した例は無い。本研究では、研究代表者が培ってきた「化学ウイルス学」に基づいた機能性分子修飾人工ウイルスキャプシドの構築技術を駆使して、脳内・標的細胞・細胞内標的部位へトラフィッキング制御する分子集積ウイルスレプリカを「化学の力」で創製する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
脳などの特定臓器・特定細胞・特定オルガネラへトラフィッキングする人工材料を構築できれば、革新的なドラッグデリバリー材料として有用であるが、これまでそのようなウイルス模倣材料を創製した例は無い。本研究では、研究代表者が培ってきた「化学ウイルス学」に基づいた機能性分子修飾人工ウイルスキャプシドの構築技術を駆使して、脳内・標的細胞・細胞内標的部位へトラフィッキング制御する分子集積ウイルスレプリカを化学の力で創製することを目的としている。
これまでの研究実績として、研究代表者が開発したエンベロープ型人工ウイルスキャプシド上に、無細胞発現系とプラスミドDNAを用いて、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)やSARS-CoV2のスパイクタンパク質を搭載した「膜タンパク質搭載ウイルスレプリカ」を創製し、それぞれのレセプターに効率的に結合することを実証した。また、血液脳関門(BBB)シャトルペプチドを提示したエンベロープ型人工ウイルスキャプシドの構築に成功し、BBBモデル細胞を効果的に透過することを見出している。さらに、核移行シグナル(NLS)を提示したエンベロープ型人工ウイルスキャプシドの構築にも成功し、NLSとエンベロープ膜の相乗効果により細胞核に集積することを実証している。
また、効率的な新規ウィルスレプリカ作製手法の開発ならびに無細胞膜タンパク質発現による複数種類の膜蛋白質の発現を行った。具体的には、脂質膜透過法を用い、天然の生体膜を効率的にコア微粒子に被覆する手法をみいだすとともに、コア微粒子としてシリカのみならず、多孔質微粒子、銀ナノ粒子を用いる系についても検討をおこなった。また、複数の膜タンパク質を搭載する系として、コネキシン-43とクラウウディンの同時発現を行い、これらが共同的に細胞間接着に関与していることを示唆する結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までにエンベロープ型人工ウイルスキャプシドに無細胞発現系を用いて対応するプラスミドDNAを発現することにより、膜タンパク質であるコネキシン、ヘマグルチニン(HA)、SARS-CoV2由来S-proteinを搭載した「膜タンパク質搭載ウイルスレプリカ」の創製に成功している。このうち、コネキシン搭載ウイルスレプリカについては、すでにRSC Chemical Biology, 2022, 3, 231にて論文発表している。HA搭載ウイルスレプリカは、抗HA抗体および金ナノ粒子修飾二次抗体の結合からHAの搭載が確認され、リガンドであるGM3含有脂質二分子膜への結合を水晶発振子マイクロバランス(QCM)により確認している。また、S-protein搭載したウイルスレプリカでは、TEM観察による突起状構造体の確認や、抗S-protein抗体および金ナノ粒子修飾二次抗体の結合のTEMによる確認、レセプターであるACE2への結合をフローサイトメトリーおよびQCMにより確認している(ACS Synthetic Biology, in revision)。その他にも、血液脳関門(BBB)シャトルペプチドや核移行シグナル(NLS)を提示したエンベロープ型人工ウイルスキャプシドの構築にも成功し、BBBモデル細胞を効果的に透過することや細胞核集積性を確認している。
エンベロープを効率的にレプリカに付与する手法として、密度勾配溶液中に作製した脂質膜層に対してナノ微粒子を透過させることで脂質膜を被覆できる実証している（Small, 2023, 19, 2206153）。今年度は、この系を拡張し、モデル膜のみならず天然の生体膜をナノ粒子に被覆する手法を開発した。さらに、生体膜についてプロテオームプロファイリングを行い、細胞の状態に応じて選択的に膜タンパク質が抽出されていることも見出している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに構築したHA搭載ウイルスレプリカのシアリルラクトース発現細胞であるヒト肝癌由来細胞株HepG2への取込過程をCLSMにより観察する。また、SARS-CoV2由来S-protein搭載ウイルスレプリカのACE2レセプターへの結合を介した細胞内取り込みについても、CLSM観察やフローサイトメトリーにより詳細に検討し、ウイルスの細胞への感染機構のモデルとしての有用性を検証する。これらの膜タンパク質搭載ウイルスレプリカにドキソルビシンやメトトレキサートなどの抗がん剤を内包し、細胞選択的な薬物送達能・治療効果などを検討する。また、BBBシャトルペプチド提示エンベロープ型ウイルスキャプシドのヒトトランスフェリンレセプターとの結合を QCMなどにより定量的に解析するとともに、in vitroでのBBB通過能をより詳細に評価する。さらに、ミトコンドリア移行シグナルペプチド(MTS)を修飾したエンベロープ型ウイルスレプリカの創製も検討し、細胞内トラフィッキングの制御とオルガネラ選択的な薬物送達を達成する。
本年度、新たに開発した膜タンパク質固相合成により、膜タンパク質の多段階合成が可能であることを見出した。今後、この手法をさらに展開し、コロナウィルスが保持する感染関連膜タンパク質や膜融合性の膜タンパク質などを複数種類、効率的に搭載したウイルスレプリカを作製し、その機能発現機序について基礎的な知見を得るとともに、ウィルスレプリカとしての細胞内トラフィッキングの制御などの機能発現を目指す。
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