| Project/Area Number |
23K23468
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| Project/Area Number (Other) |
22H02201 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37010:Bio-related chemistry
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
野村 渉 広島大学, 医系科学研究科(薬), 教授 (80463909)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2022: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR-Cas / 細胞周期 / オフターゲット作用 / アンチクリスパー / タンパク質間相互作用 |
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| Outline of Research at the Start |
CRISPR-Cas（クリスパ－キャス）システムを利用するゲノム編集技術ではより正確な編集方法としてS/G2期で優位に起こる相同組み換えの効率向上の手法とオフターゲット作用を抑制する手法の開発が求められている。応募者はこれまでに細胞周期に依存したタンパク質分解とアンチクリスパ－によるCasヌクレアーゼの阻害を利用してこの2課題を一挙に解決する手法を見出した。本研究ではより迅速なCasヌクレアーゼ活性の制御を可能にする手法を新たに確立し，より精度の高いゲノム編集法を実現する。また，この手法を塩基置換酵素（Base Editor：BE）にも適用し，制度の高い塩基置換法を確立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではタンパク質分解より迅速な応答が得られる細胞内局在変化（細胞質⇔細胞核）を利用した細胞周期制御型ゲノム編集の基盤構築を第一の目的とし，細 胞周期制御型システムをBEにも適用し，塩基置換型ゲノム編集でのDNAおよびRNAオフターゲット作用抑制の実現を第二の目的としている。2023年度は前年度に構築した細胞周期に応じて細胞内局在を変化させるドメインを融合したanti-CRISPRを用いることでCRISPR-Cas9活性の阻害効果を詳細に検討した。その結果、anti-CRISPRのみを用いる場合と比較して非相同末端結合（NHEJ）によるゲノム編集効率をより強力に阻害する効果が確認された。これまでに開発を進めてきた細胞周期依存型ゲノム編集では相同組換え（HDR）によるゲノム編集効率の向上が確認されていたが、NHEJの阻害効果がなく、HDR効率とNHEJ効率の相対比較で評価するゲノム編集の正確性の向上が課題となっており、この課題の克服に向けた進捗が得られた。dCas9-VPRによる転写活性化手法（CRISPRa）を細胞内でのCRISPR-Cas9とanti-CRISPR+Cdt1の相互作用解析については細胞周期に応じて変化するdCas9-VPR活性をレポーター蛍光タンパク質の発現で評価することができ、anti-CRISPR+Cdt1の発現量変化との相関を定量的に解析する手法を確立することができた。細胞周期依存型Base Editorの系では標的遺伝子配列を複数箇所設定してBase Editorとanti-CRISPR+Cdt1あるいはanti-CRISPR+Gemininを細胞内で同時に導入し、一塩基置換効率の評価を行い、Base Editor活性に変化が見られることを確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画に基づき、2023年度は細胞周期に応じて細胞内局在が変化するanti-CRISPRによるCRISPR-Cas9ゲノム編集効率の評価を行った。また、dCas9-VPRを活用した細胞周期に依存したCas9/anti-CRISPRの相互作用変化も定量的に解析することができた。さらに細胞周期依存型Base Editorの活性評価も進めることができた。以上のことから、順調に進展していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度については細胞周期による細胞内局在変化を起こすドメインを用いた場合にanti-CRISPRによるNHEJ型ゲノム編集の抑制が顕著である点についてその要因を明らかにし、細胞周期と細胞内局在変化を組み合わせたゲノム編集法の開発を進める。細胞周期依存型Base Editorに関しては標的配列における塩基置換効率を評価するだけでなく、DNA/RNAオフターゲットの解析を進め、本手法の有効性を検証する。
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