Integrative Structural Biology Studies on the development for safe and efficient Cas3 genome editing tools
| Project/Area Number |
23K23533
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| Project/Area Number (Other) |
22H02266 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
竹下 浩平 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 研究員 (80346808)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浜口 祐 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (00587876)
清水 伸隆 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, グループディレクター (20450934)
吉見 一人 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (50709813)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,710,000 (Direct Cost: ¥6,700,000、Indirect Cost: ¥2,010,000)
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| Keywords | Cas3 / タンパク質科学 / 構造生物学 / ゲノム編集タンパク質 / 相関構造解析 / ゲノム編集 / X線結晶構造解析 / 小角散乱 / 単粒子解析 |
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| Outline of Research at the Start |
クラス1タイプIに属するCRISPR-Cas3システムを用いた真核細胞における国産ゲノム編集ツールの開発が進んでいる。クラス2タイプIIのCas9は二本鎖DNAを切断して小さな欠失変異を導入するが、Cas3は数百~数キロに渡る大規模欠失変異を導入する。一方で二次的なDNA切断によって予期せぬ欠失変異が懸念される。この二次的なDNA切断活性の発現メカニズムを理解できれば、より安全なゲノム編集ツールとして開発が可能であるが、そのメカニズムは未だ不明である。本研究では構造解析を行い二次的なDNA切断活性を欠損させた大腸菌由来Cas3改変体の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、クラス1タイプIに属するCRISPR-Cas3システムを用いた真核細胞における国産ゲノム編集ツールの開発が進んでいる。クラス2タイプIIのCas9は二本鎖DNAを切断して小さな欠失変異を導入するが、Cas3は、標的DNAと相補的なcrRNAを結合したCascadeが標的DNA領域に結合したサイトに結合し、数百~数キロに渡る大規模欠失変異を導入する。一方で二次的なDNA切断によって予期せぬ欠失変異が懸念される。この二次的なDNA切断活性の発現メカニズムを理解できれば、より安全なゲノム編集ツールとして開発が可能であるが、そのメカニズムは未だ不明である。そのためには、ターゲットDNAのnon-target鎖を特異的に切断するメカニズムと、target鎖を切断する活性や非特異的にCas3近傍の一本鎖DNAを切断する二次的な活性のメカニズムの違いを詳細に理解する必要がある。そしてそれらのメカニズムの使い分けを可能としている構造的特徴を捉え二次的なDNA切断活性を欠損させた新規かつ安全な大腸菌由来Cas3改変体を開発する。本研究では我々が開発した大腸菌由来Cas3の効率的生産システムにより得られた高品質なタンパク質を用い、未だ明らかとなっていない大腸菌由来Cas3の原子分解能での構造解析を行い、機能と密接に関係した構造的特徴を捉える。
本研究によって開発された新しいCRISPR-Cas3システムは安全性が担保されると考えられ、新規モデル動物の開発、遺伝子治療研究等に寄与するだけでなく、Cas9関連の知財に係らない国産ゲノム編集ツールの開発を推進するものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大腸菌由来Cas3(EcoCas3)の構造情報の取得を目指し、X線結晶構造解析、小角散乱、単粒子解析を進めた。以下、それぞれの実験の進捗について記す。
①X線結晶構造解析：精製EcoCas3について約1000条件の結晶化スクリーニングを実施した。結晶化温度は10℃, 20℃で実施した。現在も結晶化スクリーニングを継続している。
②小角散乱：ゲルろ過クロマトグラフィーと連結した小角散乱測定(SEC-SAXS)を用いて、結晶構造解析が報告されている好熱菌由来Case(TfuCas3)とEcoCas3の構造の差異について追加検討を実施した。リコンビナントTfuCas3はその結晶構造に一本鎖DNAが結合しており、Cascade非依存的にDNAを切断することから、non-target鎖を切断後の状態を示すと予想した。一方でEcoCas3はTfuCas3のような非特異的な活性は示さない。SEC-SAXS測定の結果、EcoCas3はTfuCas3と比べ、ニッケースとヘリケースドメインが離れており、TfuCas3結晶構造より予測されるDNA結合領域が分離しており単独ではDNAを結合できないといった自己活性抑制状態にあるのではないかと考察した。
③クライオ電子顕微鏡による単粒子解析：EcoCas3特異的な抗体を作成し、その抗体のFab断片とEcoCas3の複合体を調製しクライオ電子顕微鏡観察を実施し単粒子解析を進めた。現時点で低分解能ではあるが得られた3D初期モデルとしてEcoCas3とFabと考えられるドメインを確認できており構造決定が期待される。
こられらの実験結果からCas3の二次的な活性は、Cas3がCascade依存的に特異的にDNAを切断する前と後では大きくドメイン配置が異なることが示唆され、本研究の目的である２つのDNA切断メカニズムの違いを理解できる構造情報が集まりつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究として、2022年度の研究成果を踏まえ計画通りに進めEcoCas3の構造決定を目指すことが可能であると考えられる。特にクライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析による構造決定を精力的に進める。また、高分解能の原子構造情報の取得が期待できるX線結晶構造解析では、現時点では結晶化スクリーニングで結晶が得られていないが、単粒子解析でも用いているEcoCas3に特異的に強く結合するFabを用いて、Fab-EcoCas3の結晶化スクリーニングも実施する価値があると考えられる。
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Report
(1 results)
Research Products
(9 results)
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[Presentation] 放射光を用いたSPring-8創薬スクリーニングパイプラインの開発2022
Author(s)
坂井直樹, 松浦滉明, 平田邦生, 竹下浩平, 奥村英夫, 水野伸宏, 村上博則, 増永拓也, 仲村 勇樹, 上野剛, 馬場清喜, 長谷川和也, 熊坂崇, 山本雅貴
Organizer
第22回日本蛋白質科学会年会
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