| Project/Area Number |
23K23551
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| Project/Area Number (Other) |
22H02284 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38050:Food sciences-related
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
好田 正 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (20302911)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
服部 誠 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (40221501)
築地 信 星薬科大学, 薬学部, 准教授 (90302611)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000)
Fiscal Year 2026: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
Fiscal Year 2025: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
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| Keywords | アレルギー / B細胞 / アレルゲン特異性 / レパトア / 遺伝 / B細胞レパトア |
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| Outline of Research at the Start |
食品アレルギーの患者は全ての食品にアレルギーを起こすわけではなく、人によってアレルゲンとなる食品は厳密に異なっている。しかし、個々の患者がどの食品にアレルギーを起こすのかがどのようなメカニズムで決まるのかは全く明らかになっていない。本研究では、各患者の体内に存在するB細胞の多様性（レパトア）に着目し、マウスをモデルとして用い、個人におけるレパトアの偏りがアレルギーを起こす食品の決定に関与しているかどうかを検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、個人におけるB細胞のレパトアの違いに着目して、アレルゲン特異性の決定機構について解析している。
昨年度は、3系統のマウスを用いてIgM陽性未感作B細胞の重鎖レパトアは系統ごとに異なることを示唆することができた。この結果は、生来的に持つB細胞のレパトアの差異がアレルゲン特異性の決定に関与している可能性を示唆している。そこで本年度は２系統のマウスを用いてIgM陽性未感作B細胞の重鎖レパトアの個体差を解析した。その結果、同じ系統でも個体差はあるものの、系統ごとに用いられている重鎖レパトアに偏りがあることが強く示唆された。用いたマウスは近郊系であり、同じ系統であればほぼ同一の遺伝的背景を持つためこの結果はB細胞のレパトアはランダムではなくある程度遺伝子の影響を受けて決定されていることを支持するものである。
さらに、重鎖のVセグメントとJセグメントの組み合わせにも偏りがあることを見いだした。この結果も、B細胞受容体の遺伝子再構成はランダムではなく一定の規則性が存在していることを意味している。
次に、この生来的なB細胞のレパトアの差異がアレルゲン特異性の決定に関与しているかどうかを検証するために、抗原特異的なB細胞のレパトアを解析した。昨年度の研究で、オバルブミン（OVA）特異的IgG1陽性B細胞のレパトアがIgM陽性B細胞のレパトアと異なっていることを示した。本年度は、この結果の信頼性を高めるためにOVA特異的B細胞の抗原特異性を再確認し、現在の検出方法でOVA特異的B細胞が選択的に分取できていることを実証した。さらに、MACS法を用いて抗原特異的B細胞を濃縮することでセルソーターによる分取を効率化できることを確認した。
次年度は、IgE陽性B細胞の分取技術を確立し、IgE陽性B細胞のレパトアを解析してIgMやIgG1との差異を検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
２年目は、２系統のマウスを用いて個体別にB細胞レパトアを解析した結果、ある程度の個体差は見られたもののそれぞれの系統でのみ検出されたVセグメントが複数存在していた。この結果は、遺伝的背景の違いにより利用されるVセグメントに偏りがあることを支持しており、これまでに知られていなかった新たな知見である。今後はさらに個体数を増やし、系統も増やして知見の信頼性を高める必要があると考えている。まずは、初年度に解析した系統の中で個体差を検証していないNC/Ngaマウスの個体差を検証する。その後、必要に応じて３系統の個体数を増やして信憑性の高いデータを取得する。
また、初年度終了時点で課題となっていた抗原特異的IgE陽性細胞の分取方法の確立については、まず抗原特異的B細胞の効率的な分取方法を確立に成功した。目的とする抗原特異的なIgE陽性細胞は存在頻度が極めて低いため、非特異的な検出ノイズは実験の精度に大きな影響を与えてしまう。そのため、抗原特異的B細胞の検出精度を確認することは極めて重要な課題である。本年度は、卵白アルブミン（OVA）特異的B細胞の染色時に非標識OVAまたは非標識牛血清アルブミン（BSA）を加えてブロッキングをしたところ、非標識OVAで染色が阻害されたのに対し、非標識BSAでは影響が見られなかったことから抗原特異的B細胞の検出精度を確認することができた。また、セルソーターに供する前にOVAで標識したB細胞を磁気細胞分離（MACS）によって事前に濃縮することで、セルソーター時における分取効率を向上させることができる可能性を示した。ただし、MACSによる濃縮時に相当数の細胞をロスしてしまうことから、今後はMACSを用いる場合と用いない場合でトータルの収率の違いを検討する必要がある。これにより、より多くの抗原特異的IgE陽性細胞を分取できる方法を今後の実験に採用する。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、NC/Ngaマウスを用いてIgM陽性B細胞の生来的なレパトアの個体差を解析する。得られた結果とこれまでに得られている２系統（BALB/cとC57BL/6）の結果を比較して、系統ごとのレパトアの差異を考察する。
また、引き続き抗原特異的IgE陽性B細胞の分取法を確立する。２年目までに抗原特異的B細胞の検出方法を確立したので、３年目はMACSの有無による全体的な収率の差異を検討して、今後の実験にMACSを用いるか否かを決定する。さらに、IgE陽性細胞の検出精度を向上するために、IgEの染色時にB細胞上に発現しているIgE受容体であるCD23のブロッキングを行う。ブロッキングの効果はIgEとIgG1を同時に染色して２重陽性細胞の頻度が低下することにより確認する。加えて、IgE陽性細胞を分取し、分取した細胞がIgE陽性細胞かどうかをRT-PCRおよびシークエンス解析により確認する。
抗原特異的IgE産生細胞の分取方法が確立されたら、OVAで免疫したBALB/cマウスの脾臓よりOVA特異的IgEおよびIgG1産生細胞を一細胞ずつ分取し、レパトアの差異を解析する。もしBALB/cマウスでIgEレパトアの解析が困難な場合は、よりIgE陽性B細胞の存在頻度が高いNC/ngaマウスから始める。
さらに、OVA以外の抗原に対しても同様な解析ができるように、BSAや主要な牛乳アレルゲンであるβ-ラクトグロブリンなどを標識した抗原を調製して、それぞれに特異的なB細胞を特異的に染色できるかどうかを確認する。確認の方法は既にOVAを用いた実験で経験済みである。抗原の染色にはFTIC標識キットを用いる。
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