Development of functional SNPs of crops and its application for identification of useful genes

• Project/Area Number: 23K23586
• Project/Area Number (Other): 22H02321 (2022-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2022-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 39010:Science in plant genetics and breeding-related
• Research Institution: Kazusa DNA Research Institute
• Principal Investigator: 平川 英樹 公益財団法人かずさDNA研究所, ゲノム事業推進部, 主任研究員 (80372746)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小野寺 康之 北海道大学, 農学研究院, 准教授 (80374619) ; 増田 税 北海道大学, 農学研究院, 教授 (60281854)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000); Fiscal Year 2025: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2024: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2022: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: 機能的SNP / ウイルス抵抗性遺伝子 / 原因遺伝子 / ゲノムワイド解析

Outline of Research at the Start

総務省統計局で公表されている農作物や公共データベースにおいて遺伝子情報が公開されていない植物種について、ペプチドを含む遺伝子を高精度に予測し、ストレス耐性候補遺伝子を含むアノテーションを整備する。品種間SNPに対して遺伝子発現やタンパク質の活性といった情報を付与した機能的SNPを定義する。ホウレンソウにおけるキュウリモザイクウイルス抵抗性遺伝子座を同定し、機能的SNPを用いて候補遺伝子を絞り込み、相補性検定により機能的SNPの有用性を検証する。本研究で実施する多種多様な植物を対象とした機能的SNPを整備することで多様な作物における様々な形質に関わる原因遺伝子の解明に役立てることを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

遺伝子機能に直接的に影響を及ぼしうる「機能的SNP」を多様な作物について明らかにし、次世代シークエンサーから得られる膨大な量のSNPの中から形質に関連性があると考えられるものを絞り込むことで、原因遺伝子の同定を目指す。さらに、優良形質などの選抜の高精度化を行い、育種の効率化を図るため、本研究では「機能的SNP」に関する情報基盤の整備を行なう。総務省統計局で公表されている作付面積と収穫量が多い31植物種を含むNCBIから入手した201植物種のゲノムデータのうち、遺伝子が公開されている119種について実施したUniProtKB、Araport、EggNOGに対する配列相同性解析の結果およびRGAuguryを用いたストレス耐性遺伝子候補の検索結果を集約したアノテーション表をGene Curation DS（https://fgi.kazusa.or.jp/gcds/）から公開した。「機能的SNP」の開発に関しては、トマトとホウレンソウを対象として実施し、世界各国でシークエンスされた様々な品種（系統）についてのリシークエンスデータを用いてSNPを検出した。ホウレンソウについては、ホウレンソウの高精度なゲノム配列を解読し、ペプチドの予測を行っている。また、「機能的SNP」を整備するため、遺伝子予測を進めている。一方、キュウリモザイクウイルス黄斑系（CMV-Y）に対する抵抗性系統と感受性系統に対する接種試験を行ない、「機能的SNP」の有用性を調べる。そのために、CMV-Y抵抗性形質が分離する系統03-009の抵抗性株および感受性株を用いてQTL-seq解析を行い、抵抗性遺伝子座をマップした。さらに、同座に関する精密マッピングを行い、「機能的SNP」情報を活用して、抵抗性候補遺伝子を絞り込んだ。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1．染色体レベルでゲノム配列が解読された作物についてのゲノム情報の整備；総務省統計局で公表されている作付面積と収穫量が多い31植物種のうち、これまで解読されていなかったピーマンについても染色体レベルのゲノム配列が解読され、31種すべてのゲノム配列が解読された。NCBIで公開されている201種のゲノム配列のうち、遺伝子配列が公開されていた119種について、非冗長化アミノ酸配列データベースUniProtKBとシロイヌナズナのアノテーションデータベースAraport、オルソログデータベースEggNOGに対する配列類似性検索を行ない、その結果をGene Curation DSから公開した。
2. ストレス耐性遺伝子候補（病害抵抗性遺伝子）の整備；上記１で入手した119種についてRGAuguryを用いてストレス耐性遺伝子候補を検出し、Gene Curation DSから公開した。
3. 品種間の多型解析に基づく機能的SNPの整備；トマトとホウレンソウを対象とし、トマトについては、NCBIのSRAデータベースで公開されている栽培種5種、マイクロトム6種、野生種6種のリシークエンスデータを入手し、SNPアノテーションを行った。ホウレンソウについては、SRAデータベースからアフガニスタンや中国、ベルギーなど各国の品種や野生種のリシークエンスデータを取得し、SOL_r1.0に対するマッピングによりSNPを検出した。
4. ホウレンソウにおける病害抵抗性の解明；キュウリモザイクウイルス黄斑系（CMV-Y）抵抗性形質が分離する系統03-009の抵抗性株および感受性株を用いてQTL-seq解析を行い、抵抗性遺伝子座をマップした。さらに、同座に関する精密マッピングを行い、「機能的SNP」情報を活用して、抵抗性候補遺伝子を絞り込んだ。

Strategy for Future Research Activity

1．染色体レベルでゲノム配列が解読された作物についてのゲノム情報の整備；NCBIから入手した201植物種のうち遺伝子配列が公開されていた119種について、ペプチドを予測する。遺伝子配列が公開されていない82種の遺伝子予測を進め、アノテーション情報をGene Curation DSから公開する。
2. ストレス耐性遺伝子候補（病害抵抗性遺伝子）の整備；新規にゲノム解読されたピーマンと遺伝子配列が公開されていない82種について遺伝子予測を行い、ストレス耐性遺伝子候補を探索する。
3. 品種間の多型解析に基づく機能的SNPの整備；トマトとホウレンソウについてSNPアノテーションを行い、SnpEffによりHIGHとMODERATEなインパクトをもつSNPに対し、遺伝子上下流に位置するSNP、ナンセンス変異を生じるSNP、非同義置換を生じるSNPに分類する。非同義置換については、機能ドメイン上および立体構造上のSNPの位置、活性部位への影響を調べることで「機能的SNP」を定義し、形質との関連性を考察する。現在、高精度化を進めているホウレンソウのゲノム配列において「機能的SNP」を開発し、他の植物種についても「機能的SNP」を整備する。
4. ホウレンソウにおける病害抵抗性の解明；これまでに、ホウレンソウにおけるCMV-Y抵抗性候補遺伝子を見出しており、本年度は当該候補遺伝子の機能解析を次の2通りの方法で試みる。① 候補遺伝子の断片が挿入された組換え型CMV-Yを作成し、これを抵抗性ホウレンソウ系統に接種する。組換え型CMV-Yによって候補遺伝子がサイレンシングされ、ホウレンソウの抵抗性が打破された場合には当該候補遺伝子が抵抗性責任遺伝子あることが証明できる。② CMV-Y感受性シロイヌナズナCol-0に抵抗性候補遺伝子を導入した形質転換体を作出し、形質転換体のCMV-Y抵抗性を調査する。