| Project/Area Number |
23K23696
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| Project/Area Number (Other) |
22H02431 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 40040:Aquatic life science-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
井尻 成保 北海道大学, 水産科学研究院, 教授 (90425421)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 敦 北海道大学, 理学研究院, 教授 (90422005)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
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| Keywords | ウナギ / チョウザメ / ティラピア / サクラマス / 卵巣分化 / ステロイド合成 / 卵成長 / 卵成熟 / アロマターゼ / 20β-HSD / ステロイド代謝酵素 / 転写調節 / 魚類 |
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| Outline of Research at the Start |
魚類の性分化、卵成長、卵成熟制御の理解は、水産重要魚種の性統御技術、人為催熟技術を確立する上で基盤となる知識である。これら全過程は、生殖腺のステロイド産生の代謝経路転換と産生量の変化によって制御されている。本研究では、それら過程の鍵となるステロイド代謝酵素の発現変動を転写調節から明らかにする。主に下垂体ホルモンが支配する性ステロイド産生の分子調節機構が卵母細胞の発達を制御するメカニズムを、チョウザメからウナギ、サケ科、ティラピアに至る条鰭類全体を網羅して調べることで、魚類進化を通したステロイド産生分子制御機構の普遍性と種の分岐を通した特異性を明らかにすることを目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、卵巣分化・卵黄形成を誘導するE2産生機構から、卵成熟誘起ステロイドであるDHPへの劇的な産生転換機構について、FSHとLHの作用機序に焦点を当てて、条鰭類全体を通して調べることを目的とする。
E2産生を制御する律速酵素、アロマターゼをコードするcyp19a1遺伝子については、ウナギにおいて、コルチゾルがFoxl2、Sf-1 およびFsh シグナルによるcyp19a1 の転写活性を増強する傾向がみられた。ストレス環境で雄化するウナギではストレスホルモンであるコルチゾルによってcyp19a1の転写が抑制されるとの予想とは逆の結果となり、ヒラメやメダカとは異なる雄化誘導機構が働いている可能性が浮上した。ダウリアチョウザメからは新たに脳から4種のcyp19a1パラログを同定し、卵巣型を含めた酵素活性を明らかにした。また、選択的スプライシングによる組織特異的転写調節機構の存在を明らかにした。
サクラマス組換えLHを昆虫細胞発現系で作製し、サクラマス顆粒膜細胞培養においてLH刺激で発現誘導される因子を複数同定した。特に、DHP産生の律速酵素である20β-HSDをコードするhsd17b12L遺伝子について、LH刺激とhsd17b12L転写活性化を介在する因子をRNA-seqによって探索し、qPCRによって9因子に候補を絞り込んだ。
ティラピア組換えFSHを遺伝的雄仔魚腹腔内に顕微注射し、ステロイド合成系に与える影響を調べた。その結果、コレステロール側鎖切断酵素、3β-HSD、cyp19a1aの発現を上昇させることがわかった。また、cyp19a1aのプロモーターは、foxl2、Sf-1による転写活性化をFSHシグナルがさらに高める作用を持つことが確認された。
以上、cyp19およびhsd17b12Lの転写調節機構の理解が進み、条鰭類全般の普遍性と特異性が明らかになりつつある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）組換えFSH、LHの作製：ステロイド産生は主にFSHとLHによって制御されており、これまでに、哺乳類細胞を用いてティラピアFSH、ウナギFSH、昆虫細胞を用いてアムールチョウザメFSH、LHを作製しており、今年度はさらにサクラマスLHも作製した。それらはゲルろ過クロマトグラフィーで高度に精製し、それぞれの魚種の組織培養実験および生体投与実験に用いることでそれぞれのステロイド合成系へ与える影響を調べることができるようになった。
（２）cyp19a1：ウナギcyp19a1遺伝子プロモーター解析では新たにコルチゾルが転写を活性化することが示されたが、これは予想と逆の結果であり、今後in vivoおよびex vivoにおいてのコルチゾルのcyp19a1転写に対する効果を調べ、ウナギ卵巣分化開始に関わるストレスホルモンの影響を評価する必要がある。ティラピアに関しては性分化期にFSHがcyp19a1a発現に与える影響はあるものの影響はfoxl2ほど大きくはなく、FSHシグナルの卵巣分化に対する必要性については明確ではない。現在、FSH受容体ノックアウトティラピアの解析を行っており、これによってFSHの性分化時のcyp19a1a発現に対する役割の重要性を明らかにする必要がある。
（３）hsd17b12L：LHが誘導するサクラマスhsd17b12L遺伝子の転写活性化に関わる因子を9因子に絞り込んでいる。これら9因子のhsd17b12L転写活性化に関わる機能の有無を明らかにすることで、LHがhsd17b12Lを発現するメカニズムが解明されると思われる。ウナギにおけるDHP産生はhsd17b12L発現ではなく17OHP産生によって制御されていると考えているが、17OHP産生を制御するcyp17a1の発現消失に関わる因子の同定には至っておらず、さらに探索を続ける必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）cyp19a1遺伝子の転写調節：ウナギではコルチゾルがプロモーター活性を上げたが、実際に、コルチゾルのウナギ生体への投与、培養卵巣への添加を行い、卵巣中cyp19a1発現の変化を調べ、コルチゾルの効果を検証する。チョウザメではアロマターゼ活性が最も高かったパラログの上流配列を用いて、卵巣型アロマターゼ発現に関わる転写因子の調節を調べる。脳型のプロモーターについてもその活性化因子を探索する。
（２）hsd17b12L遺伝子の転写調節：サクラマスのhsd17b12L遺伝子の発現についてはLH刺激を介在する転写活性化因子を絞り込んでおり、今年度はそれら因子が実際にプロモーター活性化に関わるかどうかをレポーターアッセイによって調べる。これによって、LHがDHP産生を導く分子機構を明らかにする。
（３）cyp17a1遺伝子の転写調節：これまでにウナギでは、17OHP産生の有無によってDHP産生が制御されていることを示してきた。一昨年度、卵黄形成完了後のウナギ卵濾胞培養において、LHの刺激によってcyp17a1の発現が完全に抑制されたサンプルを得ることに成功し、RNA-seq解析を進めてきたが、cyp17a1転写抑制に関わる因子の選抜には至っていない。引き続き、このデータから候補因子の探索を続け、選抜された因子を用いたプロモーターアッセイによってcyp17a1遺伝子発現を抑制する因子の同定を目指す。
（４）ティラピア卵巣分化へのFSHの関与：これまでFSH刺激が性分化期の生殖腺におけるcyp19a1aの発現を補助的に高めるというデータを示したが、実際にFSH刺激が卵巣分化にどれほど必要かは明確ではない。作製したFSH受容体遺伝子破壊ティラピアのcyp19a1a発現および遺伝的雌魚の性分化を明らかにすることで、その役割を明らかにする。
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