| Project/Area Number |
23K23744
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| Project/Area Number (Other) |
22H02479 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 41050:Environmental agriculture-related
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
眞家 永光 北里大学, 獣医学部, 准教授 (00453514)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 奈津子 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(廿日市), 主任研究員 (20612675)
静 一徳 地方独立行政法人青森県産業技術センター, 水産部門, 主任研究員 (50753307)
池永 誠 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (70511822)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,710,000 (Direct Cost: ¥6,700,000、Indirect Cost: ¥2,010,000)
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| Keywords | 2-MIB / カビ臭 / 発生予測 / 発生防除 / ファージ / 微生物生態 / 水環境修復 / ファージレメディエーション |
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| Outline of Research at the Start |
この研究は，富栄養湖における異臭味被害抑止対策を新たに提案するものです。世界中の湖沼等で，シアノバクテリアが産生する2-メチルイソボルネオール（2-MIB）によるカビ臭被害が生じています。そこで本研究では，2-MIB被害が頻発している汽水湖において，2-MIB産生菌の種類や動態を明らかにします．そして，水質や気象などの環境因子を用いて2-MIB発生を定量的に予測するモデルを構築します。その上で，2-MIB産生菌を溶菌するバクテリオファージを活用し，2-MIB産生菌の増殖を抑制する生物学的防除技術「ファージレメディエーション」を開発します。
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| Outline of Annual Research Achievements |
予察モデル開発に必要な2-MIB産生シアノバクテリアの増殖に及ぼす植物プランクトンの種間関係を明らかにするため，16SrRNA遺伝子のアンプリコンシーケンス解析で得られた植物プランクトン組成を利用した群集解析を行った．その結果2-MIB産生種が存在する群集と存在しない群集は明瞭な2つのクラスターに分類され，2-MIB産生種と配列相同性の高いASVはシアノバクテリアの限られたASVと有意な共起関係を有することを明らかにした．
cnbB遺伝子を標的として，Pseudanabaena属に特異的なプライマーを設計し，小川原湖から採取した湖水試料を用いて菌叢解析を行った．次世代シークエンスによるアンプリコン解析の結果，2023年10月に採取した湖水ではPseudanabaena foetida var. intermediaが主要であった一方，2022年9月に採取した湖水ではPseudanabaena limnetica str. Castaic Lakeが主要であり，種レベルで年次変動が生じることが見出した．
2-MIB産生シアノバクテリアの底質における分布特性の解明に資するために，小川原湖底質の化学的特性とシアノバクテリアの増殖に影響を及ぼす自由生活性線虫の分布を調べ，小川原底質の有機物の起源・組成，および自由生活性線虫の分布は，南北及び鉛直方向に異なることを明らかにした．
小川原湖の湖水や底泥からファージ画分を抽出し，2-MIB産生シアノバクテリア培養株A1F1-4及びA1F1-26に感染するファージのスクリーニングを行った．最も基本的なファージのスクリーニング法である二層寒天法では，明確なプラークが得られなかったものの，菌の色が薄くなったものや臭いが薄くなったものについて精製を行い，ファージ画分を回収した．また，菌株が有する溶原性ファージの粒子を回収した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2-MIB産生種の網羅的菌叢解析に必要なプライマーも計画通り設計でき，湖水試料も順調に収集している．2-MIB産生菌の種レベルでの時期的変動を明らかにする準備はほぼ整った．
また，毎月のモニタリング調査による湖水の水質と微生物叢の解析は順調に進んでおり，2-MIB発生の有無によって微生物叢が異なることが明らかなった．これらの結果を取り入れた予察モデルの開発も順調に進んでいる．また，2-MIB産生菌に感染するファージの探索も大きなトラブルなく進行している．以上のことから，本研究は，おおむね順調に進展している，と判断した
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| Strategy for Future Research Activity |
■テーマ１ 2-MIB産生Pseudanabaena属細菌の動態解明■
2-MIB 遺伝子のcnbBを標的として，当該研究で独自に設計したプライマーで2-MIB産生Pseudanabaena属細菌の菌叢解析を配列レベル（菌株レベル）で網羅的に実施する．大量発生時期においては， cnbB のmRNAを標的とした菌叢解析も実施し，2-MIBを産生している主要なPseudanabaena菌株を特定する．これより，2-MIB産生菌の構成比を菌株レベルで整理し，地理的・経時的動態を明らかにする．とりわけ，2-MIB生産Pseudanabaenaの発生初期は，ファージレメディエーションによる防除に重要な時期である．このため，特異的プライマーを独自に設計して定量PCR解析を実施し，2-MIB産生Pseudanabaena属細菌の量的変動を解明する．
■テーマ２ 2-MIB発生の事前予測モデルの開発■ 2-MIB産生菌の増減と微生物叢，水質等因子の関係をネットワーク解析やクラスター解析等の統計解析により明らかにし，その結果を加味して，微生物叢や水質，気象等から2-MIBの発生を事前に予測する定量的なモデルの構築を行う．予察対象はテーマ1で得られた2-MIB産生寄与率の高いPseudanabaena菌株とする．微生物叢の情報は16S rRNA遺伝子や18S rRNA遺伝子の次世代シークエンスにより取得する．
■テーマ３ ファージを活用した防除技術開発に向けた研究■
小川原湖内の2-MIB産生菌株を単離してコレクションを拡充し， 2-MIB産生寄与率が高い産生菌株を選抜する．異なる時期・地点より採取した湖水や底質中のファージ画分を，2-MIB産生菌株に接種し，プラーク法によってファージを分離・精製する．ファージの形態学的特徴は透過型電子顕微鏡観察により明らかにする．遺伝情報については，核酸を抽出後，NGSによりゲノムを解読し，2-MIB産生に関わる領域等を推定するなど，遺伝的特徴を明らかにする．
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