Development of overcoming the species barrier of xenopregnancy technology

Research Project

Project/Area Number	23K23761
Project/Area Number (Other)	22H02496 (2022-2023)
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Multi-year Fund (2024) Single-year Grants (2022-2023)
Section	一般
Review Section	Basic Section 42010:Animal production science-related
Research Institution	Niigata University
Principal Investigator	山城秀昭新潟大学, 自然科学系, 教授 (60612710)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	菅原淳史東北大学, 大学病院, 助教 (00554403) 阿部学新潟大学, 脳研究所, 准教授 (10334674)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000) Fiscal Year 2025: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2024: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000) Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2022: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Keywords	異種胚盤胞補完法 / エピゲノム編集 / 多能性幹細胞 / 異種配偶子産生システム / 異種間キメラ / CRISPRoff / エピジェネティクス / CRISPRoffノックインマウス / gRNAノックインマウス / 異種間配偶子生産システム / 異種配偶子産生 / ゲノム編集 / ES細胞 / 異種間配偶子産生システム
Outline of Research at the Start	本研究は、異種胚盤胞補完法、エピゲノム技術および多能性幹細胞技術を融合し、げっ歯類のラットおよび大型産業動物であるウシの生殖巣および生殖細胞を性成熟までの2ヶ月で小型実験動物のマウス生体内で作製する異種配偶子産生システムを確立し、さらに、生殖細胞形成の”種を越えた普遍性”という新たな要素を加え、家畜生産短期化に応用できる革新的技術を開発する研究に位置付けられる。
Outline of Annual Research Achievements	現在のゲノム編集ツールにおいて、CRISPR/Cas9は簡便かつ迅速に高い効率であらゆる遺伝子のノックアウトやノックインを可能にするが、オフターゲット効果や内在的な修復に依存しており、挿入や欠損がランダムに発生する。一方で、塩基配列を変えることなく遺伝子の機能を制御するDNAメチル化が注目され、2021年にはDNAメチル化転移酵素をCRISPR/Cas9に応用したCRISPRoffシステムが報告された。このシステムは、標的遺伝子への特異性が高く、長期的なメチル化の維持を可能にした。しかし、このシステムはヒト培養細胞でのみ報告されており、マウスなどの生体で機能させた報告はない。そこで令和5年度の研究では、CRISPRoffシステムを導入したマウスのエピジェネティクス研究への応用を目的とし、CRISPRoffノックインマウス、gRNAノックインマウスの作製に取り組んだ。またin vitroでのCRISPRoffの機能性を検証した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ①相同組換えES細胞のインジェクションによって、10匹の雄キメラ産子の獲得に成功した。さらに、自然交配によってCRISPRoff発現マウス（ヘテロ）を獲得した。 ②Nanos3-gRNAベクターを使用して2回、Prdm14-gRNAベクターを使用して2回GONAD法を行った結果、Nanos3では27匹中1匹のKI個体が得られ、Prdm14では9匹の産子を得たが、KI個体は得られなかった。 ③各処理区は対照区と比較して、Prdm14の相対発現量は、1～2割の減少であり、対照区に対して有意な変化は見られなかった。哺乳類においてDNAメチル化は主に遺伝子プロモーター領域のCG（シトシングアニン）配列のシトシンがメチル化される。遺伝子は、1.プロモーター領域にGC配列を多く含む領域（CpGアイランド）が存在する遺伝子2.遺伝子内部にCpGアイランドが存在する遺伝子3.プロモーター領域、遺伝子内部どちらにもCpGアイランドが存在しない遺伝子の3種類に類別できる。この内、主にDNAメチル化よる遺伝子発現の抑制が生じるのは1のみであるとされている。実験で対照とした遺伝子であるPrdm14はプロモーター領域にCpGアイランドが存在しない。③の結果から、Prdm14の遺伝子発現量の変化が見られなかった原因は、Prdm14の遺伝子発現の制御はDNAメチル化によって行われるのではなく、別のエピジェネティクスが関与している可能性が推察された。
Strategy for Future Research Activity	CRISPRoff発現マウスのホモ個体を作製し、Nanos3-gRNAマウスとの交配を行い生体でのCRISPRoffシステムの機能性を評価する。また、DNAメチル化解析で利用されるバイサルファイトシーケンスやMSP（メチル化特異的PCR）などにも着手し、DNAメチル化に関するより詳細な解析を行う予定である。