| Project/Area Number |
23K23809
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| Project/Area Number (Other) |
22H02545 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山崎 智弘 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 特任講師(常勤) (90732280)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
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| Keywords | 非膜オルガネラ / lncRNA / 相分離 / ソフトマター物理 / architectural RNA / 細胞内相分離 / 非膜性構造体 / RNAウイルス / 構成的アプローチ / パラスペックル / 核内ストレス体 / ミセル化 / 非膜性オルガネラ / RNA / ブロック共重合体 / NEAT1 / SARS-CoV-2 |
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| Outline of Research at the Start |
細胞は、生化学反応を時空間的に制御する必要がある。そのため、細胞は、相分離機構により誘導される「非膜性構造体」を利用することで、複雑な細胞内反応を支えている。申請者は、RNAが必須の骨格となる非膜性構造体を解析し、RNAがその設計図として働き、形成や機能発現を規定していることを明らかにしてきた。しかし、その理解は十分ではなく、体系的な理解には至っていない。そこで、本研究では、ソフトマター物理学や構成的アプローチなども取り入れ、RNAとそのパートナーであるRNA結合タンパク質が構築する非膜性構造体の構造・物性・機能を規定する原理を解析し、多様かつ複雑な細胞内非膜性構造体の作動原理を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内相分離は、細胞内の混雑した環境で、特定の分子を集約した区画を作り上げることで、細胞内の様々なプロセスを潤滑に進める重要な機構である。本研究では、RNAが相分離により誘導する非膜性構造体がどのように働くのかを明らかにすることを目的にしている。そのため、RNAによって誘導される代表的な非膜性構造体について、その形成機構を明らかにすることを計画している。本研究で目指す重要な目的の1つが、パラスペックルの形成原理であるミセル化の分子実体の解明である。パラスペックルはこのミセル化の機構を介してコアシェル構造を持つ形態を作ることができる。この解明のために重要なのが、シェルを構成する タンパク質が何かという点である。これまでに、このシェルを構成するタンパク質を一つ同定していたが、本年度の解析から、他にも同様の性質を持つものの存在が明らかになった。さらに、変異体をを作成し解析を進めた。もう1つの本研究の重要な課題は、構成的なアプローチによる非膜性構造体の形成と性状規定メカニズムの解明である。そのため、ライブラリーの拡張を行い、様々なRNA結合タンパク質を発現するコンストラクトの作成を進めた。さらに、様々な足場となるRNAの配列を変更したものを作成し、安定発現株の樹立を行った。具体的には、様々な数・長さのMS2サイトを持った足場RNAなどを発現する細胞株を樹立し、今後のRNA足場の変化による非膜性構造体の性質への影響を解析するための準備を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定通り、パラスペックルのシェルを構成するタンパク質の同定や変異体解析など、ブロック共重合体のミセル化という新規の細胞内相分離機構の分子基盤の解明につながる重要な知見を着実に得てきている 。さらに、人工構造体実験系の解析を用いて、様々なRBPを発現させるMCP-RBPライブラリーを構築し、その精製・正しく精製されているかを確認を行い、ライブラリーを順調に拡張できた。さらに、来年度の解析につながる細胞株の樹立などが進んだことからこのように判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の方針としては、現状の解析を順当に進めていくことで目標を達することができると考えている。パラスペックルのシェル構成タンパク質については、同定したタンパク質を用いた解析を進め、どのようにミセル化に寄与しているかを明らかにするための解析を進める。その解析手法の一つとして、同定したタンパク質をデグロン法により急速に分解する系を立ち上げ、その際のパラスペックルの形態への変化を超解像度顕微鏡を用いた観察などにより解析する。また、人工的な非膜性構造体形成実験系を用いて、様々なタンパク質について構造体の誘導活性を調べることや足場RNAを変化させた際の構造体の性状への影響を解析する。
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