| Project/Area Number |
23K23815
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| Project/Area Number (Other) |
22H02551 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
新冨 圭史 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (60462694)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
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| Keywords | 染色体 / 細胞周期 / ヌクレオソーム / 分裂期 / 再構成 / コンデンシン / サイクリン依存性キナーゼ / DNAトポロジー / クロマトソーム |
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| Outline of Research at the Start |
分裂期染色体は遺伝情報の継承に不可欠な細胞内構造体である。本研究では、ナノメートルサイズの小さな構造要素が、マイクロメートルサイズの染色体の高次構造構築にいかに貢献するのかを理解することを目指す。そのために、研究代表者が開発した独自の手法（カエル卵無細胞系や精製因子を用いた再構成系）を駆使した解析を行う。具体的には、「ヌクレオソーム」、「クロマトソーム」、「DNA超らせん」という3つの構造要素に対して精緻な実験操作を施し、その影響を解析することで、それぞれの要素の役割を検討する。最終的には、異なる実験系から得られた情報を統合し、マルチスケールな視点で染色体の新しい描像を提示する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
分裂期染色体は細胞分裂に伴う遺伝情報の分配に不可欠な超分子構造である。「ゲノムDNAとタンパク質からなる染色体がどのようにして形作られるのか」という細胞生物学分野の積年の課題を解くため、私たちは、カエルの精子DNAとわずか六種類の精製タンパク質（コンデンシンⅠ、トポⅡ、コアヒストン、三種類のヒストンシャペロン）を用いて染色体を再構成できるプロトコルを開発した。本研究は、これらの染色体構築に必要最低限のタンパク質うち、とくに、コンデンシンⅠの動作原理を理解することを目標として進めている。
従来の再構成系では、分裂期のカエル卵抽出液から精製した「リン酸型」コンデンシンⅠを用いる必要があった。本研究では、まず、リン酸化を介したコンデンシンⅠの活性制御の実態を理解するために、サイクリン依存性キナーゼCdk1とサイクリンBのリコンビナントタンパク質複合体を調製し、それを用いてリコンビナント・コンデンシンⅠの大規模なリン酸化を試験管内で再現できるプロトコルを確立した（Shintomi et al, 2024, PLOS ONEとして発表した）。さらに、2023年度には、リン酸化したリコンビナント・コンデンシンⅠの野生型や変異体を用いて、染色体再構成を促進する条件を検討した。その結果、コンデンシンIが染色体構築を促進するためには、そのコア領域と天然編成領域の両者がリン酸化される必要があるという確証を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時には、染色体構築において「ヌクレオソーム」、「クロマトソーム」、「DNAの超らせん」が果たす役割を理解することを目標として掲げた。当初の計画通りではないものの、リン酸化に依存した染色再構成実験を確立することができ、結果の一部を論文として報告できた。さらに、コンデンシンⅠの活性制御についても、すでに有力な結果を得ており、続報の投稿に向けた道筋が見えつつある。
また、当初の目的の一部についても有望な解析結果が得られつつある。コンデンシンⅠがトポⅡともにDNAの超らせんを制御する活性を有することを考慮し、これらの二つの因子の働きにフォーカスした共同研究を進めている。この研究では、DNA一分子レベルでの観察に基づき、「DNAの超らせん」が染色体構築にどのように関わっているのかについて独自の視点から検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度が計画の最終年度であることを考慮し、当初の計画のうち「ヌクレオソーム」や「クロマトソーム」に着目した計画を、一旦、凍結する。コンデンシンⅠの活性制御に関しては、リン酸化が「可逆的」な分子修飾であることに着目した解析に注力する。すなわち、Cdk1でリン酸化したコンデンシンⅠを使って染色体を再構成した後、これを脱リン酸化した時の影響を検討する。すでに、リコンビナントのPP2Aホスファターゼを精製し、これを使って（あらかじめリン酸化された）コンデンシンⅠを脱リン酸化することに成功している。具体的には、再構成染色体の形状、あるいは、コンデンシンⅠのクロマチン結合やDNAに超らせんを導入する活性が、リン酸化／脱リン酸化によってどのように変化するのかを調べる。さらに、これらの解析にコンデンシンⅠやトポⅡの変異体を導入することによって、より詳細なメカニズムを明らかにしていく。最終的には上記の計画を通じて、今年度内に論文投稿を目指す。
また、リン酸化されたコンデンシンⅠのDNA上での動態を理解するため、蛍光顕微鏡を用いた一分子解析、また、クライオ電子顕微鏡を用いた観察にも挑戦する。これらの計画を通じて、今後の研究のたたき台となる予備データの収集にも努めたい。
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