Molecular mechanism of substrate selection and cleavage by intramembrane protease in lipid bilayer

• Project/Area Number: 23K23825
• Project/Area Number (Other): 22H02561 (2022-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2022-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 禾 晃和 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (40379102)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000); Fiscal Year 2025: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2024: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2023: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2022: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
• Keywords: 膜内タンパク質切断 / シグナル伝達 / クライオ電子顕微鏡 / X線結晶解析 / Ｘ線結晶解析

Outline of Research at the Start

膜内プロテアーゼは、細胞膜に蓄積する不要なタンパク質を除去して膜の品質を管理するとともに、シグナル伝達タンパク質を細胞膜から切り離すことで活性化するという二重の役割をもつ。本研究では、様々なタンパク質を切断する膜内プロテアーゼが、どのように切断するタンパク質と切断しないタンパク質を見分けているのかを明らかにすることを目的とする。病原性細菌の膜内プロテアーゼは、宿主への感染や薬剤耐性化にも関与することが示唆されており、切断するタンパク質を見分ける仕組みを明らかにすることは、特異性の高い新規抗菌剤の開発にもつながることが期待される。

Outline of Annual Research Achievements

継続して取り組んできたRsePのX線結晶解析が完了し、大腸菌由来RseP（EcRseP）と海洋性細菌K. koreensis由来のRsePオルソログ（KkRseP）の2つのタンパク質について、いずれも阻害剤Batimastatとの複合体の構造を決定することができた。Batimastatはペプチド様の構造をとる低分子化合物であり、RsePの膜内領域に形成されたβシート（MREβ-sheet）に主鎖を介して相互作用していた。また、MREβ-sheetの反対側からAsn-394が側鎖を介してBatimastatと水素結合し、Batimastatを活性中心近傍に固定していた。Asn-394は、RsePオルソログだけでなく、S2Pファミリー全体でも保存されている残基であり、この残基に変異を導入すると、Batimastatの阻害効果と基質切断活性の両方が低下することが分かった。この変異体解析の結果は、基質タンパク質もBatimastatと同様にMREβ-sheetに結合し、Asn-394によって固定された状態で切断を受けることを強く示唆するものである。また、X線結晶解析の結果、EcRsePでは、4番目の膜貫通ヘリックス（TM4）と膜表在性ヘリックス（PCT-H2）が静電的に相互作用することが明らかになった。そして、この静電的相互作用を破壊するような変異が既知の活性変異と同等の活性の低下を引き起こすことが分かり、TM4やPCT-H2が切断制御において重要な役割を担うことが示唆された。さらに、EcRsePとKkRsePの結晶構造の比較から、これらのタンパク質は基質取り込みの過程で構造変化を起こす可能性が示された。この結果を受けて、構造変化の検証のためにクライオ電子顕微鏡による構造解析に着手することとし、RsePに対して結合する抗体の探索も行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

X線結晶解析の進展により、RsePの基質切断メカニズムについての理解が深まるとともに、クライオ電子顕微鏡解析を行う際に必要な抗体の探索も順調に進んだことから。

Strategy for Future Research Activity

クライオ電子顕微鏡解析に利用可能な抗体の候補は挙がってきたことから、より高分解能な構造情報を取得するためのグリッド作製条件を検討していく。

Research Products

• [Journal Article] Mechanistic insights into intramembrane proteolysis by E. coli site-2 protease homolog RseP (2022)
  • Author(s): Imaizumi Yuki、Hirata Kunio、Nogi Terukazu et al.
  • Journal Title: Science Advances Volume: 8 Issue: 34
  • DOI: 10.1126/sciadv.abp9011
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hybrid in vitro/in silico analysis of low-affinity protein-protein interactions that regulate signal transduction by Sema6D (2022)
  • Author(s): Tanaka Tsubasa、Ekimoto Toru、Nagatomo Meri、Neyazaki Makiko、Shimoji Erena、Yamane Tsutomu、Kanagawa Sakura、Oi Rika、Mihara Emiko、Takagi Junichi、Akashi Satoko、Ikeguchi Mitsunori、Nogi Terukazu
  • Journal Title: Protein Science Volume: 31 Issue: 11
  • DOI: 10.1002/pro.4452
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ネイティブ質量分析による膜タンパク質RsePと亜鉛・阻害剤の結合状態の解析 (2022)
  • Author(s): 志田 智哉、田尻 道子，禾 晃和，明石知子
  • Organizer: 第70回質量分析総合討論会
• [Presentation] 膜内タンパク質切断の制御機構の解明に向けた細菌由来 Site-2 protease の構造生物学的研究 (2022)
  • Author(s): 2.今泉友希、髙貫一徳、大井里香、坂口(田村)梨沙子、三好賢一、有賀 理江、廣瀬建、片桐静夏、三宅拓也、檜作洋平、秋山芳展、禾晃和
  • Organizer: 第18回21世紀大腸菌研究会
• [Presentation] 全長結晶構造に基づく大腸菌膜内切断プロテアーゼRsePの基質取り込み・切断機構の解析 (2022)
  • Author(s): 3.三宅拓也、今泉友希、髙貫一徳、小林達也、横山達彦、大井里香、檜作 洋平、禾晃和、秋山芳展
  • Organizer: 第18回21世紀大腸菌研究会
• [Presentation] 膜内切断プロテアーゼRsePのネイティブ質量分析による特性解析 (2022)
  • Author(s): 志田智哉、田尻道子、禾晃和、明石知子
  • Organizer: 第95回日本生化学会大会
• [Presentation] 抗体アフィニティー精製への応用に向けたLpMab-7 FabとRIEDLペプチドの複合体のX線結晶構造解析 (2022)
  • Author(s): 安達 友里子、金子 美華、加藤 幸成、禾 晃和
  • Organizer: 2022年度日本結晶学会年会
• [Remarks] 構造医科学部門・構造生物学研究室（禾グループ）
  • URL: http://www.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp/xtal-mls/members/nogi/index.html