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Elucidation of the catalytic mechanism of copper-containing nitrite reductase by the cooperation of experiment and calculation

Research Project

Project/Area Number 23K23829
Project/Area Number (Other) 22H02565 (2022-2023)
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeMulti-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023)
Section一般
Review Section Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
Research InstitutionNational Institutes for Quantum Science and Technology

Principal Investigator

玉田 太郎  国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 上席研究員 (50391248)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) リントゥルオト 正美  京都府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (10275191)
福田 庸太  大阪大学, 大学院薬学研究科, 助教 (20783179)
平野 優  国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 主幹研究員 (80710772)
Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help
¥15,990,000 (Direct Cost: ¥12,300,000、Indirect Cost: ¥3,690,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,190,000 (Direct Cost: ¥6,300,000、Indirect Cost: ¥1,890,000)
Keywordsタンパク質 / 立体構造 / 中性子・X線 / 量子化学計算 / 窒素循環 / 中性子・X線
Outline of Research at the Start

地球上の窒素循環中の脱窒過程において亜硝酸イオンを一酸化窒素に一電子還元する反応を触媒する銅含有亜硝酸還元酵素(CuNIR)に着目し、水素原子の直接観察に長け、無損傷状態での回折データ収集が可能な中性子を中核に据え、X線を相補的に組み合わせた構造解析を実施する。また、中性子構造解析で正確に決定した原子核位置に基づき、化学反応に直接関わる価電子を超高分解能X線構造解析で描写し、生体高分子内金属反応場の分子軌道情報を取得する。さらに、実験構造との整合性を担保した量子化学計算により各スナップショット間を補完しながらCuNIRの反応機構の全体像を映出する。

Outline of Annual Research Achievements

本年度は昨年度に引き続き、基質結合酸化型としてT1Cu認識に関与するシステイン残基(Cys135)をアラニンに置換したC135A変異体と基質である亜硝酸イオンとの複合状態での中性子結晶構造解析結果と量子化学計算結果の検証を行い、溶媒の誘電率の効果を考慮した計算により双方の実験結果の整合性を得ることが出来た。また、さらに触媒残基の1つであるアスパラギン酸残基(Asp98)をアスパラギンに置換したC135A/D98N変異体と亜硝酸イオンとの複合状態でのX線結晶構造解析を0.9Å分解能で実施し、亜硝酸イオンの複数の結合モードを確認した。
また、休止状態酸化型においてT2Cuに配位した水酸化物イオンの状態を再検証するために、中性子回折データ収集を室温下で実施し、1.6Å分解能程度の回折点を確認できた。現在、中性子回折データの処理を実施中である。さらに、CuNIRに電子を供与するシュードアズリン(Paz)の構造解析を室温下で収集した回折データ(中性子:1.9Å分解能、X線:1.3Å分解能)を用いて実施した。併せて低温下でのX線結晶構造解析を0.86Å分解能で行い、得られた解析結果から活性中心の銅イオン認識に関与するヒスチジン残基(His81)のアミド窒素およびプロトンがペプチド平面からずれ、同じく銅イオン認識に関与するシステイン残基(Cys78)の硫黄原子と弱いNH-S結合を形成していた。中性子構造を用いて量子化学計算を実施した結果、この弱いNH-S結合がLUMOのエネルギー準位を低下させることで、酸化還元電位を上昇させていることが示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

基質結合酸化型の構造解析を完了したことに加え、電子伝達パートナータンパク質の構造解析結果を論文発表することが出来た。

Strategy for Future Research Activity

基質結合酸化型から基質結合還元型への反応過程の検証を実験と計算の双方から行い、その成果を論文発表する。

Report

(2 results)
  • 2023 Annual Research Report
  • 2022 Annual Research Report
  • Research Products

    (7 results)

All 2024 2023 2022

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (6 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 3 results)

  • [Journal Article] Overlooked Hydrogen Bond in a Blue Copper Protein Uncovered by Neutron and Sub-angstrom Resolution X-ray Crystallography2024

    • Author(s)
      Fukuda Yohta、Lintuluoto Masami、Kurihara Kazuo、Hasegawa Kazuya、Inoue Tsuyoshi、Tamada Taro
    • Journal Title

      Biochemistry

      Volume: 63 Issue: 3 Pages: 339-347

    • DOI

      10.1021/acs.biochem.3c00517

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 量子でひもとくタンパク質のかたちとはたらき2024

    • Author(s)
      玉田太郎
    • Organizer
      大人が楽しむ科学教室
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] タンパク質の中性子結晶構造解析の現状と今後2023

    • Author(s)
      玉田太郎
    • Organizer
      日本顕微鏡学会第79回学術講演会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Neutron structural analyses of copper-containing nitrite reductase2023

    • Author(s)
      Tamada Taro, Fukuda Yohta, Hirano Yu, Kusaka Katsuhiro, Lintuluoto Masami , Inoue Tsuyoshi
    • Organizer
      26TH CONGRESS AND GENERAL ASSEMBLY OF THE INTERNATIONAL UNION OF CRYSTALLOGRAPHY
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Structure and function of membrane-bound copper containing nitrite reductases from class Actinomycetes2023

    • Author(s)
      Shobu Keigo, Fukuda Yohta, Tanino Hiroki, Arakawa Nao, Inoue Tsuyoshi
    • Organizer
      26TH CONGRESS AND GENERAL ASSEMBLY OF THE INTERNATIONAL UNION OF CRYSTALLOGRAPHY
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 量研で実施している中性子結晶構造解析の現状2023

    • Author(s)
      玉田太郎、平野優、廣本武史、栗原和男
    • Organizer
      令和5年度日本結晶学会年会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] 電子伝達タンパク質の高分解能構造解析2022

    • Author(s)
      玉田太郎
    • Organizer
      東京大学物性研究所短期研究会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Invited

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Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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