| Project/Area Number |
23K23835
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| Project/Area Number (Other) |
22H02571 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
秋山 芳展 京都大学, 医生物学研究所, 教授 (10192460)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森 博幸 京都大学, 医生物学研究所, 准教授 (10243271)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
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| Keywords | 大腸菌外膜 / 膜タンパク質分解 / タンパク質構造 / タンパク質機能制御 / タンパク質品質管理 / 外膜タンパク質 / 表層プロテアーゼ / トリアージ / 分子シャペロン / 大腸菌 |
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| Outline of Research at the Start |
細菌外膜は、菌の生存に必須の機能を持つ。本研究は、大腸菌BepA proteaseによる外膜タンパク質の運命選別 (トリアージ)とその制御機構を解明し、外膜構造と機能の維持におけるその意義の理解をめざす。
本研究では以下の項目について、多角的な手法で取り組む。
(I) BepA分子内に埋もれた活性部位での基質結合を可能にする構造変化の実態を解明する。 (II) LptD生合成過程での、BepA-LptD-BAM相互作用と、BepA機能切り替え機構を解明する。 (III) BepA基質を網羅的に同定し解析することで、BepAの細胞機能の全体像を理解する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
外膜タンパク質LptDは、外膜機能に必須のリポ多糖の生合成に働く。 申請者らは、大腸菌BepAタンパク質が2つの機能を持ち、外膜の BAM複合体(外膜タンパク質トランスロコン)上で正常なLptD分子は外膜へのアセンブリーを促進し(Chaperone様機能)、異常分子は分解除去する(Protease機能)、 即ちトリアージすることで、外膜の構造と機能維持に働く事を示したが、その分子機構の詳細や生理機能の全容は不明である。申請者らが2019年に解明したBepA の結晶構造では、protease 活性部位がα6 loop とα9 loop と名付けた二つのループ領域に覆われて分子内に深く埋没した構造をとっている。基質が活性部位に アクセスするためには、これらが大きく構造変化し、活性部位領域が露出するものと予想された。α6 loop とα9 loopは一部が密接に相互作用しており、この相互作用がこれら領域の可動性に関わる可能性が考えられた。これらを踏まえて変異解析を行った結果、α6 loop とα9 loopの相互作用部位に存在する残基の変異によりBepA機能制御が異常となり、正常にアセンブリーをしているLptD分子もBepA依存的に分解されることがわかった。さらに、α6 loop とα9 loop それぞれの近傍に存在する高度に保存されたArg-252 残基と Glu-201 残基の変異により、同様にBepA機能制御が異常となることも見出した。様々な変異解析の結果から、これら2つの残基は塩橋を形成することで、α6 loop とα9 loopを適切内地に保持することも示唆された。
また、α6 loop の直下に導入したCys残基の修飾性を指標として、結晶構造とは異なりin vivoではα6 loop が主として開いた構造を取ることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
理由
システマティックな変異解析と生化学解析により、BepA機能制御にα6 loop とα9 loop相互作用の重要性を示し、また、細胞内におけるα6 loopの動態についての手掛かりを得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
予定通り、さらなる変異解析や再構成系を用いた解析等を通じてBepAの機能制御機構を明らかにする。また、作製した変異体の構造解析や生化学的アプローチに よるBepA構造変化の実態解明も進める。
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