| Project/Area Number |
23K23840
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| Project/Area Number (Other) |
22H02576 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Kwansei Gakuin University |
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Principal Investigator |
沖米田 司 関西学院大学, 生命環境学部, 教授 (90398248)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 宏隆 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (70432804)
福田 亮介 関西学院大学, 生命環境学部, 助教 (90825308)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000)
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| Keywords | ERAD / 逆輸送 / タンパク質品質管理 / ユビキチンリガーゼ / retrotranslocation / 小胞体品質管理 / 膜タンパク質 / ユビキチン |
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| Outline of Research at the Start |
ユビキチンE3リガーゼ RNF5/RNF185経路以外の重要な逆輸送およびERAD責任分子を特定するために、RNF5/185二重欠損細胞での候補分子の機能阻害実験を行い、CFTR変異体や様々なERAD基質への影響を明らかにする。また、細胞内およびin vitroでの結合解析により、ERAD関連分子、特にユビキチンE3リガーゼが認識する分解基質の最小単位を特定する。さらに、E3リガーゼ結合領域を含む膜タンパク質の逆輸送およびERADにおけるユビキチンE3リガーゼ阻害効果を調査し、ユビキチンE3リガーゼの基質選択性の分子メカニズムを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
A-1. 新規ERADモデル基質の構築と分解機構の解明：ERAD-M基質Insig-1，ERAD-C基質ABCB1のERADをリアルタイムに追跡するHiBiT assayを確立した．また，Insig-1については，HiBiT tagの位置を小胞体内腔に変えることで，そのretrotranslocationのリアルタイム定量が可能となった．
A-2. 多重機能阻害実験による逆輸送関連分子の作用点解明: RNF5/RNF185二重欠損細胞を用いた解析により，細胞質のHECT型E3 ligase UBE3CおよびHERC3がRNF5/185経路とは独立してCFTR変異体のERADを促進することを明らかにした．本研究成果は，国際誌Cells (DOI: 10.3390/cells12232741)およびJ Cell Biol (DOI: 10.1083/jcb.202308003) に受理された．さらに，多様なERADモデル基質を用いた解析により，RNF5, RNF185, HERC3はERAD-C基質 (CFTR, ABCB1) のretrotranslocationおよびERADを選択的に促進することを明らかにした．
B-1. NanoBiT法による逆輸送分子の基質結合解析: NanoBiT法により，CFTR変異体との結合に関わるRNF185内の相互作用領域の候補を見出した．今後，精製タンパク質を用いたin vitro結合解析により，直接的な結合について解析する予定である．
C-1. プロテオリポソームを用いた逆輸送機構の解析: 無細胞合成系により，CFTR含有プロテオリポソームの調製に成功した．AlphaScreenによる結合実験の結果，HERC3はリポソーム中のCFTR膜貫通領域と結合しないが，リポソーム外に出ると結合することを見出した．従って，HERC3は膜から露出したCFTR膜貫通領域を認識すると考えられる．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ほぼ予定通りに研究成果が得られており，UBE3CとHERC3に関する知見については，２報の査読付き原著論文（Kamada et al, Cells 2024 & Kamada et al, J Cell Biol 2024）として受理されたため．
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 無細胞タンパク質合成系と共に，大腸菌タンパク質発現系を用いたin vitro結合実験も進め，逆輸送関連分子とERADモデル基質との相互作用機構を明らかにする．
2. 新たに確立したTCRalpha-TM-HiBiTキメラ分子を用いたERADリアルタイム定量解析により，逆輸送分子が認識する最小配列（デグロン）に起因するERAD促進効果が，逆輸送分子機能阻害で抑制されるか否かを明らかにする．本解析により，逆輸送分子によるERAD制御の基質選択性について知見を得る．
3. RNF5/RNF185二重欠損細胞で発現増加したE3リガーゼの機能解析も進め，論文発表まで進める．
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