| Project/Area Number |
23K23842
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| Project/Area Number (Other) |
22H02578 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
金城 政孝 北海道大学, 先端生命科学研究院, 名誉教授 (70177971)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北村 朗 北海道大学, 先端生命科学研究院, 講師 (10580152)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000)
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| Keywords | 回転拡散運動 / 併進拡散運動 / 相関関数 / 偏光 / 蛍光相関分光法 / 情報伝達 / 回転拡散測定 / ２量体形成 / 偏光測定 / 並進拡散運動 |
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| Outline of Research at the Start |
本申請ではタンパク質の2量体化とそれに与える細胞内微環境の影響を同時に解明するために分子量サイズの変化に敏感で回転拡散測定可能な偏光蛍光相互相関分光装置（Pol-FCCS）の新規構築を行う。特に細胞内微環境を反映する細胞内分子混雑状態がタンパク質の2量体形成と機能へ与える影響を明らかにし，さらに細胞内で相互作用するタンパク質の相互作用の定量的手法の開発を通して研究を発展的に進める。
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞情報伝達には多くのタンパク質が関与している。その中でも2量体化して細胞質から核へ移行し，情報を伝達する仕組みは，情報伝達因子や転写因子に多く存在している。しかし「2量体化」と「移行」の間には相反する要因がある。それは2量体化することで構造的には安定化すると考えられているが，2量体化することで分子量が大きくなれば，移行するためには多くのエネルギーが必要であり，また輸送時間がかかることから，情報伝達では不利になる。このようにタンパク質が2量体化をする理由については不明なことが多く，その理由は明確にされていない。
特に核内受容体の一つであるグルココルチコイドレセプター (GR)は，細胞情報伝達分子として糖代謝のみならず，免疫制御・抗炎症作用から精神的な情緒まで広く関与している。GRのシグナル伝達の最終段階は2量体化しDNAに結合する転写活性にあるが，申請者らはその前段階のホモならびにヘテロ2量体形成量が核内受容体の多様な機能を支えると考えた。
本研究ではGRの2量体化量とそれに与える細胞内微環境の影響を同時に解明するために分子量サイズの変化に敏感で回転拡散測定可能な偏光蛍光相互相関分光装置（Pol-FCCS）の新規構築を続ける。特にPol-FCCSから得られるパラメーターのうち，分子数を決定することのため，Alexa系蛍光色素と，Fluorescein系蛍光色素を用いて，共焦点領域の大きさの決定を行った。
また，細胞測定に向けて，細胞内タンパク質の発現パターンを調べる必要性から科研費予算を利用して外注してNeuro2a並びに293細胞のtoral RNA解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
申請者の研究室で自作した偏光蛍光相関分光装置（正立型Pol-FCS）を改良して細胞測定が可能な倒立型-２波長偏光蛍光装置を引き続き構築中である。既設のPol-FCS装置は検出器2台を用いた2 channel 型であるため，初段で蛍光の偏光成分を二つに分け，次にハーフミラーで分けていた部分にダイクロイックミラー(DM)を装着し短波長側と長波長側に分け，相互関数シグナルとして検出する構成とした。この光路設計で波長の異なる蛍光成分を検出し，且つ，アフターパルス成分を除くことが可能となる。但し，縦成分，横成分偏光それぞれ２色蛍光を検出することで，最低４台の検出器とデジタル相関器が２台必要なったため，検出器2台と相関器1台を購入した。
今年度はPol-FCS装置の検出装置を2台のAvalanche Photon Detector（APD）からMPPC（Multi-Pixel Photon Counter，浜松ホトニクス）に変更した。MPPCは光子の検出効率はAPD（～70%）に比較すると～40%であり若干効率は落ちるものの，受光面が広いため光軸調整が比較的簡便となることが期待され，且つ蛍光をほぼ損失せず検出することが可能となった。
本年度は，Pol-FCCSの共焦点領域の大きさを決定することを目指した。そのためまず濃度既知として知られてるNIST（アメリカ標準局）製Fluorescein溶液を利用するために，レーザー強度と蛍光発光が比例関係にある範囲を決め，かつ，最大蛍光強度となるレーザーパワーを決定した。しかし，そのレーザーパワーは約0.5μWであり，そのため蛍光発光量も低く，その条件下では十分な蛍光シグナルを得るためには2時間から3時間の測定時間が必要と分かった。さらに，その間の測定の間に，MPPCの検出効率が変化することが判明した。これは半導体結晶欠陥に由来するバイスタビリティに起因する可能性が高いことが判明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き検出器であるMPPCの感度特性の理解と調整を進める。
蛍光の偏光成分を分けるには，二つの手法がある。現状の初段に縦横偏光を分けてから，蛍光を分けるか，２色の蛍光を分けてから縦横偏光を分けるか，である。２年目以降は，その二つの手法を比較しつつ，バンドパスフィルター等の光学特性を考慮しより感度よくシグナルが取れる装置に改良していく予定。
光学調整の重要な部分としてFCSでは共焦点系を構築するためにピンホール調整がある。一方で，申請者らが開発した不当分割光ファイバーを用いることで光学調整が不要になる可能性がある。Pol-FCS装置においても，偏波保持光ファイバーを利用して，この可能性を確かめる予定。これを達成することで，装置全体が安定化し，細胞測定の有利なることが想定される。
GFP-ｍCherrey（ポジコン）やGFP-GRとmCherry-GRを対象として，2量体化したたんぱく質複合体形成をFCCS測定を行い装置の調整を行う。それと並行して，GRの生理的機能差を明確に解析できる細胞種の選定を行う。特にGRの場合には内在性GRが少ないことが知られているN2A細胞を一つの候補とする。
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