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過渡現象解析で追求する膜輸送タンパク質の多段階構造変化と輸送素過程の連関

Research Project

Project/Area Number 23K23843
Project/Area Number (Other) 22H02579 (2022-2023)
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeMulti-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023)
Section一般
Review Section Basic Section 43040:Biophysics-related
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

菊川 峰志  北海道大学, 先端生命科学研究院, 准教授 (20281842)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 宮内 正二  東邦大学, 薬学部, 教授 (30202352)
塚本 卓  北海道大学, 先端生命科学研究院, 助教 (30744271)
海野 雅司  佐賀大学, 理工学部, 教授 (50255428)
Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
Keywords膜輸送 / イオンポンプ / 微生物ロドプシン
Outline of Research at the Start

何らかの機能を発現する蛋白質の多くは、多段階の構造変化を経て機能を実現している。このような「分子機械」として働く蛋白質の仕組みを理解するため、膜蛋白質が行う膜輸送現象を研究対象とし、多段階の構造変化と、基質の各輸送ステップの関係の解明を目指す。試料としては、イオンポンプとして働く微生物ロドプシンを用いる。微生物ロドプシンは、光で瞬間的に活性化できる。この利点を生かして、短寿命で出現する種々の中間体を過渡応答解析によって検出し、その中間体で起こる輸送素過程を解明する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、膜輸送蛋白質を研究対象とし、多段階の構造変化と、基質の各輸送ステップの関係の解明を目指している。試料としては、イオンポンプとして働く微生物ロドプシンを用いている。この蛋白質は、光で瞬間的に活性化できるため、短寿命で出現する種々の中間体を過渡応答解析によって検出できる。今年度は、Cl-ポンプロドプシンの分子機構について、以下の知見を得た。
1) 細胞質側のCl-輸送に不可欠なアミノ酸残基の同定
イオンポンプロドプシンの細胞質側は疎水的である。H+ポンプでは、この部位に位置する酸性アミノ酸が、高速なH+移動に重要であるが、他のイオンポンプの仕組みは不明であった。そこで、Cl-ポンプにとって重要なアミノ酸を探索したところ、6番目のヘリックスに位置するLeu及びPhe残基の置換によって、透過速度は100倍以上遅くなるが、その近傍に位置するLys残基を同時に置換すると、遅延が大きく回復することを見出した。この結果から、Cl-ポンプでは疎水性アミノ酸だけで輸送経路を構成し、他の親水性成分と相互作用させないことが高速なCl-移動に重要であることが示唆された。
2) Cl-放出・取込み中間体の同定
輸送メカニズムを考察する上で、これらの中間体の同定は必須である。そこで、Cl-選択膜を用いた電気化学的な測定を行なった。基質の放出と取込みは異なるタイミングで起こるため、溶液中の基質濃度の増加と減少を伴う。この濃度変化は非常に微小であり検出は難しいが、本実験では、Cl-ポンプロドプシンをCl-選択膜に吸着させることで、Cl-選択膜近傍で、比較的大きなCl-濃度変化を起こすことを狙った。その結果、濃度変化を膜電位変化として検出することに成功し、さらに、この結果を、Cl-ポンプロドプシンの過渡的な吸収スペクトル変化と比較することで、Cl-放出と取込みが起こる中間体を同定することに成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Cl-ポンプロドプシンについて、基質の放出と取込みが起こるタイミング(中間体)を同定したことで、その前後で、起こらなければいけない素過程も考察することが可能となった。また、一見、役割が無いように思える疎水性残基が、Cl-の高速移動に不可欠であるという知見を得たことで、H+ポンプとの違いを考察することも可能となった。

Strategy for Future Research Activity

Cl-選択膜を用いた測定は、本研究で確立したオリジナルの測定方法であり、Cl-輸送素過程と中間体生成の関係を解明する上で強力なツールとなり得る。今後は、種々のアミノ酸置換変異体にこの測定を適用することで、アミノ酸個々の役割を調べながら、Cl-輸送経路の解明を目指していく。

Report

(2 results)
  • 2023 Annual Research Report
  • 2022 Annual Research Report
  • Research Products

    (39 results)

All 2024 2023 2022

All Journal Article (11 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 11 results,  Open Access: 6 results) Presentation (28 results) (of which Int'l Joint Research: 7 results,  Invited: 3 results)

  • [Journal Article] Configurational Changes of Retinal Schiff Base during Membrane Na<sup>+</sup> Transport by a Sodium Pumping Rhodopsin2024

    • Author(s)
      Fujisawa Tomotsumi、Kinoue Kouta、Seike Ryouhei、Kikukawa Takashi、Unno Masashi
    • Journal Title

      The Journal of Physical Chemistry Letters

      Volume: 15 Issue: 7 Pages: 1993-1998

    • DOI

      10.1021/acs.jpclett.3c03435

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Multistep conformational changes leading to the gate opening of light-driven sodium pump rhodopsin2023

    • Author(s)
      Sato Yukino、Hashimoto Tsubasa、Kato Koji、Okamura Akiko、Hasegawa Kaito、Shinone Tsukasa、Tanaka Yoshikazu、Tanaka Yoshiki、Tsukazaki Tomoya、Tsukamoto Takashi、Demura Makoto、Yao Min、Kikukawa Takashi
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 299 Issue: 12 Pages: 105393-105393

    • DOI

      10.1016/j.jbc.2023.105393

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] The preferential transport of NO3- by full-length Guillardia theta anion channelrhodopsin 1 is enhanced by its extended cytoplasmic domain2023

    • Author(s)
      Ohki Yuya、Shinone Tsukasa、Inoko Sayo、Sudo Miu、Demura Makoto、Kikukawa Takashi、Tsukamoto Takashi
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 299 Issue: 11 Pages: 105305-105305

    • DOI

      10.1016/j.jbc.2023.105305

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Key determinants for signaling in the sensory rhodopsin <scp>II</scp>/transducer complex are different between <i>Halobacterium salinarum</i> and <i>Natronomonas pharaonis</i>2023

    • Author(s)
      Matsunami‐Nakamura Risa、Tamogami Jun、Takeguchi Miki、Ishikawa Junya、Kikukawa Takashi、Kamo Naoki、Nara Toshifumi
    • Journal Title

      FEBS Letters

      Volume: 597 Issue: 18 Pages: 2334-2344

    • DOI

      10.1002/1873-3468.14711

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      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structure and Heterogeneity of Retinal Chromophore in Chloride Pump Rhodopsins Revealed by Raman Optical Activity2023

    • Author(s)
      Ohya Masaiku、Kikukawa Takashi、Matsuo Junpei、Tsukamoto Takashi、Nagaura Ryota、Fujisawa Tomotsumi、Unno Masashi
    • Journal Title

      The Journal of Physical Chemistry B

      Volume: 127 Issue: 21 Pages: 4775-4782

    • DOI

      10.1021/acs.jpcb.3c01801

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      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Elucidation of a Thermodynamical Feature Attributed to Substrate Binding to the Prokaryotic H+/Oligopeptide Cotransporter YdgR with Calorimetric Analysis: The Substrate Binding Driven by the Change in Entropy Implies the Release of Bound Water Molecules from the Binding Pocket2023

    • Author(s)
      Akiko Omori, Shotaro Sasaki, Takashi Kikukawa, Kazumi Shimono, and Seiji Miyauchi
    • Journal Title

      Biochemistry

      Volume: - Issue: 11 Pages: 1608-1618

    • DOI

      10.1021/acs.biochem.2c00673

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      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Efficient recombinant production of mouse-derived cryptdin family peptides by a novel facilitation strategy for inclusion body formation2023

    • Author(s)
      Song Yuchi、Wang Yi、Yan Shaonan、Nakamura Kiminori、Kikukawa Takashi、Ayabe Tokiyoshi、Aizawa Tomoyasu
    • Journal Title

      Microbial Cell Factories

      Volume: 22 Issue: 1 Pages: 9-9

    • DOI

      10.1186/s12934-023-02016-2

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      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Phenylazothiazoles as Visible-Light Photoswitches2023

    • Author(s)
      Runze Lin, P. K. Hashim, Saugata Sahu, Ammathnadu S. Amrutha, Nusaiba Madappuram Cheruthu, Shakkeeb Thazhathethil, Kiyonori Takahashi, Takayoshi Nakamura, Takashi Kikukawa, Nobuyuki Tamaoki
    • Journal Title

      Journal of the American Chemical Society

      Volume: - Issue: 16 Pages: 9072-9080

    • DOI

      10.1021/jacs.3c00609

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      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Mutations conferring SO42- pumping ability on the cyanobacterial anion pump rhodopsin and the resultant unique features of the mutant2022

    • Author(s)
      Yuhei Doi, Jo Watanabe, Rytota Nii, Takashi Tsukamoto, Makoto Demura, Yuki Sudo, Takashi Kikukawa
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 12 Issue: 1 Pages: 16422-16422

    • DOI

      10.1038/s41598-022-20784-6

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Reisomerization of retinal represents a molecular switch mediating Na+ uptake and release by a bacterial sodium-pumping rhodopsin2022

    • Author(s)
      Fujisawa, T., Kinoue, K. Seike, R., Kikukawa, T., Unno, M.
    • Journal Title

      Journal of biological chemistry

      Volume: 298 Issue: 9 Pages: 102366-102366

    • DOI

      10.1016/j.jbc.2022.102366

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Three-Dimensional Structure of the Antimicrobial Peptide Cecropin P1 in Dodecylphosphocholine Micelles and the Role of the C-Terminal Residues2022

    • Author(s)
      Hao Gu, Takasumi Kato, Hiroyuki Kumeta, Yasuhiro Kumaki, Takashi Tsukamoto, Takashi Kikukawa, Makoto Demura, Hiroaki Ishida, Hans J. Vogel, Tomoyasu Aizawa
    • Journal Title

      ACS Omega

      Volume: 7 Issue: 36 Pages: 31924-31934

    • DOI

      10.1021/acsomega.2c02778

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      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Unknown role of the extended cytoplasmic domain of anion channelrhodopsin2023

    • Author(s)
      Yuya Ohki, Tsukasa Shinone, Sayo Inoko, Miu Sudo, Makoto Demura, Takashi Kikukawa, Takashi Tsukamoto
    • Organizer
      第61回 日本生物物理学会年会
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      2023 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Structural and functional properties of bacteriorhodopsin reconstituted in highly fluorinated dipalmitoylphosphatidylcholine membranes2023

    • Author(s)
      Daiki Kojima, Ai Nakagawara, Takafumi Shimoaka, Takashi Kikukawa, Toshiyuki Takagi, Hiroshi Takahashi, Hideki Amii, Masashi Sonoyama
    • Organizer
      第61回 日本生物物理学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] Synchronicity of gate closing and transient proton release from Asp234 in Guillardia theta anion channelrhodopsin 12023

    • Author(s)
      Miu Sudo, Sayo Inoko, Takuma Watanabe, Makoto Demura, Takashi Kikukawa, Takashi Tsukamoto
    • Organizer
      第61回 日本生物物理学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] Structure and Heterogeneity of Retinal Chromophore in Chloride Pump Rhodopsins Revealed by Raman Optical Activity2023

    • Author(s)
      Masashi Unno, Masaiku Ohya, Takashi Kikukawa, Junpei Matsuo, Takashi Tsukamoto, Ryota Nagaura, Tomotsumi Fujisawa
    • Organizer
      第61回 日本生物物理学会年会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] Configurational change of retinal Schiff base chromophore in a sodium pump rhodopsin2023

    • Author(s)
      Tomotsumi Fujisawa, Kouta Kinoue, Ryouhei Seike, Takashi Kikukawa, Masashi Unno
    • Organizer
      第61回 日本生物物理学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] Attempts to strategic functional modifications of ion pump rhodopsins2023

    • Author(s)
      Kaito Hasegawa, Tomoya Maeda, Satoru Fukiya, Takashi Tsukamoto, Makoto Demura, Takashi Kikukawa
    • Organizer
      第61回 日本生物物理学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] Effect of the phytanyl groups and membrane-spanning cross-linkage on structure and photocycle of bR in ether-linked phospholipid membrane2023

    • Author(s)
      Ami Harasawa, Ai Nakagawara, Takafumi Shimoaka, Toshiyuki Takagi, Takashi Kikukawa, Hiroshi Takahashi, Masashi Sonoyama
    • Organizer
      第61回 日本生物物理学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] Actinobacteria-derived novel outward proton-pumping rhodopsins having long photocycle2023

    • Author(s)
      Shota Takahashi, Mako Ueno, Fumio Hayashi, Takashi Kikukawa, Ichiro Kasano, Yusuke Inoue, Masashi Sonoyama
    • Organizer
      第61回 日本生物物理学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] The cytoplasmic domain regulates the photocurrent lifetime of anion channelrhodopsin GtACR12023

    • Author(s)
      Hana Maruyama, Shoko Hososhima, Satoshi Tsunoda, Yuya Ohki, Takashi Kikukawa, Takashi Tsukamoto, Hideki Kandori
    • Organizer
      第61回 日本生物物理学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] 光駆動Cl-ポンプ蛋白質が起こす過渡的な基質放出・取込み過程の直接観測2023

    • Author(s)
      濱田 知快, 村部 圭祐, 塚本 卓, 出村 誠, 菊川 峰志
    • Organizer
      第23回日本蛋白質科学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] 光駆動型Cl-ポンプ蛋白質の疎水性チャネルにおける高速Cl-輸送メカニズム2023

    • Author(s)
      ザイ 郁博, 下坂 杏奈, 塚本 卓, 出村誠, 菊川峰志
    • Organizer
      第23回日本蛋白質科学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] Structure and Heterogeneity of Retinal Chromophore in Chloride Pump Rhodopsins Revealed by Raman Optical Activity2023

    • Author(s)
      Masaiku Ohya, Junpei Matsuo, Takashi Kikukawa, Takashi Tsukamoto, Tomotsumi Fujisawa, Masashi Unno
    • Organizer
      19th International Conference on Chiroptical Spectroscopy
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      2023 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] クライオ時間分解ラマン分光法によるナトリウムポンプロドプシンの研究:O中間体における発色団構造変化2023

    • Author(s)
      藤澤 知績, 木ノ上 晃汰, 清家 陵平, 菊川 峰志, 海野 雅司
    • Organizer
      第17回分子科学討論会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] 好冷性細菌由来の新規微生物ロドプシンにおける特徴的な光物性2023

    • Author(s)
      高橋 渉太, 上野 真琴, 林 史夫, 菊川 峰志, 園山 正史
    • Organizer
      第23回日本蛋白質科学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] 一方の疎水鎖末端をフッ素化した新規リン脂質F4-Hybridに再構成した膜タンパク質バクテロリオロドプシンの特徴2023

    • Author(s)
      中川原 亜依, 高木 俊之, 菊川 峰志, 高橋 浩, 網井 秀樹, 下赤卓史, 園山 正史
    • Organizer
      第49回生体分子科学討論会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] A possible gate-opening mechanism of Indibacter alkaliphilus sodium pump rhodopsin2022

    • Author(s)
      Takashi Kikukawa
    • Organizer
      19th International Conference on Retinal Proteins
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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Retinal conformations in microbial rhodopsins probed by Raman optical activity2022

    • Author(s)
      Masashi Unno, Tomotsumi Fujisawa, Takashi Kikukawa
    • Organizer
      19th International Conference on Retinal Proteins
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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Essential residues for fast chloride ion transport of Natronomonas pharaonis halorhodopsin2022

    • Author(s)
      Zhai Yubo, Anna Shimosaka, Takashi Tsukamoto, Makoto Demura, Takashi Kikukawa
    • Organizer
      19th International Conference on Retinal Proteins
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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Biological role and molecular mechanism of preferential NO3- transport by full-length Guillardia theta anion channelrhodopsin 12022

    • Author(s)
      Yuya Ohki, Ryouhei Ohtake, Yukino Sato, Takuma Watanabe, Jo Watanabe, Makoto Demura, Takashi Kikukawa, Takashi Tsukamoto
    • Organizer
      19th International Conference on Retinal Proteins
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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Comparative study in thermodynamics of microbial proton-pumping rhodopsins identified in various temperature environments2022

    • Author(s)
      Ryouhei Ohtake, Kaori Kondo, Makoto Demura, Takashi Kikukawa, Takashi Tsukamoto
    • Organizer
      19th International Conference on Retinal Proteins
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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Gate closing mechanism of anion channelrhodopsin synchronized with transient proton release2022

    • Author(s)
      Sayo Inoko, Takuma Watanabe, Tsukasa Shinone, Makoto Demura, Takashi Kikukawa, Takashi Tsukamoto
    • Organizer
      19th International Conference on Retinal Proteins
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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 多様な温度環境に分布するプロトンポンプ型ロドプシンの熱力学的性質の網羅的解析2022

    • Author(s)
      Ryouhei Ohtake, Kaori Kondo, Makoto Demura, Takashi Kikukawa, Takashi Tsukamoto
    • Organizer
      第60回 日本物物理学会年会
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      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] Time-resolved cryo-Raman study of Na+ uptake and release by a sodium pumping rhodopsin from Indibacter alkaliphilus2022

    • Author(s)
      Tomotsumi Fujisawa, Kouta Kinoue, Ryouhei Seike, Takashi Kikukawa, Masashi Unno
    • Organizer
      第60回 日本物物理学会年会
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      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] 多孔質ハイドロゲル固体試料中における紫膜積層に適した孔サイズ分布2022

    • Author(s)
      Yasunori Yokoyama, Morise Karasawa, Kingo Takiguchi, Hiroshi Takahashi, Takashi Kikukawa, Masashi Sonoyama, Koshi Takenaka
    • Organizer
      第60回 日本物物理学会年会
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      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] 光駆動型Cl-ポンプ・ハロロドプシンの細胞質型ハーフチャンネルにおける高速Cl-輸送のメカニズム解明2022

    • Author(s)
      Zhai Yubo, Anna Shimosaka, Takashi Tsukamoto, Makoto Demura, Takashi Kikukawa
    • Organizer
      第60回 日本物物理学会年会
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      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] 光駆動Cl-ポンプhalorhodopsin の基質放出・取込み中間体の同定2022

    • Author(s)
      Chihaya Hamada, Keisuke Murabe, Takashi Tukamoto, Makoto Demura, Takashi Kikukawa
    • Organizer
      第60回 日本物物理学会年会
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      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] 低温ラマン分光法による光駆動Cl-ポンプNMR3 の発色団構造変化の研究2022

    • Author(s)
      Natsuki Ejima, Tomotsumi Fujisawa, Takashi Kikukawa, Masashi Unno
    • Organizer
      第60回 日本物物理学会年会
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      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] 陸生アクチノバクテリア由来の新規微生物ロドプシン群2022

    • Author(s)
      Mako Ueno, Fumio Hayashi, Takashi Kikukawa, Masashi Sonoyama
    • Organizer
      第60回 日本物物理学会年会
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      2022 Annual Research Report

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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