| Project/Area Number |
23K23845
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| Project/Area Number (Other) |
22H02581 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Institute of Science Tokyo |
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Principal Investigator |
徳永 万喜洋 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (00192659)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
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| Keywords | 超解像イメージング / １分子イメージング軌跡追跡 / 移動部分軌跡解析法 / 動態・局在ナノ相関解析 / HILO照明 / 生物物理 / バイオイメージング / 細胞情報・動態 / 生体分子計測 / 超解像顕微鏡 / 液相分離 |
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| Outline of Research at the Start |
「分子を観て、機能を知る」ことを目的とする。
申請者らが開発した超解像１分子多種同時イメージング法を統合的に用いる。
低背景のTIRF（全反射照明）/HILO（薄層斜光）照明法の新規改良法を開発し、超解像・１分子・領域イメージングをリアルタイム同時に、蛍光4色までの多種分子生細胞イメージングを行う。
部分軌跡解析法により、分子動態と分子間相互作用の多種データを、時間・空間の関数として定量し、各種解析法を加え、多種定量データを取得する。
当手法を、転写における液相分離の生理的機能解明に適用する。
多種多様な時空間定量データ群を統合的に関連付け、分子機能を解明する『動態・ナノ局在・機能相関学』を創出する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
「分子を観て、機能を知る」ために、申請者らが開発した超解像１分子多種同時イメージング法を統合的に用い、動態・ナノ局在・機能“場”同時、かつ、多種分子同時の分子イメージング、多種類データ取得、多様な時空間定量データ群を統合的に相関解析し、分子機能を解明する『動態・ナノ局在・機能相関学』を創出することを目的として、次を行った。１．超解像１分子多種同時イメージング顕微鏡の改良。『動態・ナノ局在・機能相関学』創出に必要な性能を満たすべく、高精度高速超解像イメージングと１分子蛍光イメージングを生細胞で同時観察できる４色対応蛍光顕微鏡として、照明方法の新規改良法開発を中心に改良した。２．蛍光標識分子の調製。RNAポリメラーゼIIの転写過程ごとの動態・相互作用を区別し、ヒストンバリアントによる違いを可視化すべく、各種分子を導入した。３．１分子イメージング動態解析。申請者らの開発した移動部分軌跡解析法を用い、１分子イメージング軌跡追跡により、分子動態・分子間相互作用情報を時間・空間の関数として定量するシステムに、新しい定量情報解析法を導入した。４．超解像解析。局在化方式(PALM/STORM) 超解像画像を、20～30 nm程度以上の高精度にてナノ局在解析する方法を改良した。５．領域マーカー対応、。超解像と１分子軌跡の重ね合わせ画像（2～3色）に、1～2色の領域マーカー画像を重ね合わせ、分子局在・分子動態・相互作用を、注目領域と関連付け、時空間関数として定量するシステムを開発した。６．以上の３～５に加え、多種定量データ取得を行い、以上で得られたデータ郡を、相互に関連付けながら、一連の解析フローとして相関解析するプログラムシステムSlitflowを構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分子機能を解明する『動態・ナノ局在・機能相関学』を創出するため、超解像１分子多種同時イメージング法を統合的に用い、動態・ナノ局在・機能“場”同時、かつ、多種分子同時分子イメージング、多種多様な時空間定量データ群を統合的に相関解析し、「分子を観て、機能を知る」ことを可能にすべく、本年度の研究計画を推進した。「１．超解像１分子多種同時イメージング顕微鏡の改良」においては、生細胞で４色までの多色対応蛍光顕微鏡として、HILO照明法の新規改良法を考案し導入した。「２．蛍光標識分子の調製」においては、木村宏研究室のRNAP2 S2ph-mintbody, 種々のヒストンvariantを導入した。「３．１分子イメージングによる動態解析」においては、申請者らの開発した、分子動態を時間・空間の関数として定量計測する方法である移動部分軌跡解析法を用いた、多種類定量データ取得・解析方法に、有効ばね定数と移動範囲面積を導入した。「４．超解像解析」の局在化方式(PALM/STORM) 超解像のナノ局在解析に関し、多様な定量データ群の取得・解析方法を改良した。以上の解析と「５．領域マーカー対応」「６．多種多様データの統合的相関解析」を統合的に行うプログラム・システムとして、解析ワークフローの新しいオープンソースフレームワークであるSlitflowを開発した。1)独自開発法に、公開されているツールを合わせ、各の利点を生かして統合的に組み合わし、2)様々な最先端解析を、完全性と柔軟性を備えたワークフローとして単一パイプラインに組み上げるものである。Slitflowは、多種多様なデータと手法に対応し、統合的解析への道を開くものである。以上、いずれも、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．超解像１分子多種同時イメージング顕微鏡の改良。『動態・ナノ局在・機能相関学』創出に必要な性能を満たすべく、高精度高速超解像イメージングと１分子蛍光イメージングを生細胞同時観察できる４色対応蛍光顕微鏡の改良を進める。特に、TIRF（全反射照明法）/HILO（薄層斜光）照明法の新規改良法を確立する。２．蛍光標識分子の調製。遺伝子の転写開始・伸長における液相の役割を時空間的に解明するため、液相関連分子、核内構造体構成分子を導入する。３．１分子イメージング動態解析。申請者らの開発した１分子移動部分軌跡解析法を用い、分子動態を時間・空間の関数として定量計測し、動態・分子間相互作用に関する多種類情報を時空間の関数として解析するシステムに、動態による分類・クラスター化等を導入して、多種定量データ取得解析方法を改良する。４．超解像解析。局在化方式超解像画像の高精度ナノ局在解析法を、1分子イメージング軌跡追跡データにも、同様に適用する。1分子動態と超解像解析とを、関連付けながら行うソフトウェアシステムとして、昨年度開発のSlitflow法を発展させる。５．領域マーカー対応。超解像と１分子軌跡の重ね合わせ画像に、複数色の領域マーカー画像を重ね合わせ、分子局在・動態・相互作用を、注目領域と関連付け、時間・空間の関数として定量する機能をシステムに導入する。６．多種定量データ取得。３～５の解析結果を統合し、多種類のデータを時間・空間の関数として定量する方法を導入する。７．cluster解析を加え、得られるデータ群を、相互に関連付け、一連の解析フローとして相関解析するべくソフトウェアシステムを発展させる。８．以上により、『動態・ナノ局在・機能相関学』創出に向け、データ群取得解析システムを構築する。［研究協力者］九州大学・生体防御医学研究所 伊藤由馬 クロマチン動態１分子超解像観察と解析
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