| Project/Area Number |
23K23849
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| Project/Area Number (Other) |
22H02585 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
林 文夫 神戸大学, 理学研究科, 名誉教授 (80093524)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森垣 憲一 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 教授 (10358179)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2022: ¥9,620,000 (Direct Cost: ¥7,400,000、Indirect Cost: ¥2,220,000)
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| Keywords | 人工膜 / Gタンパク質共役受容体 / ロドプシン / 支持脂質二層膜 / 一分子追跡 / artificial cell membrane / supported lipid bilayer / GPCR / rhodopsin / transducin / nanodisc / patterned lipid bilayer / single molecule imaging / Gタンパク質 / ペプチドナノディスク / 組込み方法 / Gタンパク質信号系 / トランスデューシン / 再構成 / タンパク質組込み膜 / 蛍光一分子観察 / ナノディスク |
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| Outline of Research at the Start |
人工膜の中でもガラスなどの表面に形成できる支持脂質二層膜は、一分子レベルでの膜タンパク質や脂質の動態や2次元微細分布などを研究できる点で有効な研究手段であり、応用の可能性も高い。特に、リガンド結合性のGタンパク質共役受容体（GPCR)を支持脂質二層膜に組込できれば、多様なバイオセンサーの実現の道を拓く事ができる。申請者らは、独自のパターン化重合脂質二層膜技術と新規なペプチドナノディスクを用いて、多様な細胞間情報伝達に関与しているGPCRをパターン化された支持脂質二層膜に組み込む新技術を開発しつつある。本計画では、簡便かつ再現性の良い支持脂質二層膜へのGPCRの組込技術を完成させたい。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題の目的は、真核生物の細胞膜で発現し、光、味、ホルモン、フェロモン、神経伝達物質など広範な外部刺激を細胞内に伝える受容体=Gタンパク質共役受容体（GPCR) を、ガラス表面に支持された脂質二層膜（supported-lipid bilayer: SLB) に組み込む技術を確立しようとするものである。
我々は 両親媒性のα ヘリカルペプチド (A18) とリン脂質が作る準安定的ナノディスクに、光を受容する GPCRである ロドプシン(rhodopsin: Rh) を内包させ、それを独自のパターン化重合脂質二層膜の枠内に投入すると、ナノディスクを構成するリン脂質とRhが枠内に自発展開し、Rh をSLBに組み込めることを発見した。この発見を基にして、 まず組み込まれたRhが本当にGタンパク質トランスデューシン(Gt)を活性化する能力を保持しているかを確認するため、蛍光標識Gtを光退色Rh*に結合させて複合体を作り、それをナノディスクに入れSLBに展開してみた。その結果、枠内に組み込まれた複合体は拡散性を維持すると共に、GTPの添加によって解離したGtのより速い拡散を確認でき、人工膜上でのGtの正常な活性が強く示唆された。また、本結果は、RhはSLBに組み込まれる際に分子的立体障害となるGtを上にして組み込まれていることも示唆している。このような研究成果を生むために、Gt/Rh*複合体をナノディスクに組み込む方法として、カラム内で生成したRh*ナノディスクと蛍光標識 Gtをカラム内で結合させる手法も開発した。また、その複合体がGTPによるGtの活性化に伴ってカラム内で解離することも確認出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実のところ23年度は液体クロマトグラフィー装置など様々な基盤的設備の故障などトラブルが続いて、思ったようには研究を進めることはできなかったが、忍耐強く多くの障害を克服して、以下のような成果を上げることができた。
蛍光標識したGtを光依存的にRhに結合させて複合体を作り、それをナノディスクに入れSLBに展開し、SLB中を自由拡散する蛍光Gtを確認することができた。この結果は、ナノディスクがガラス表面に SLB を進展させる際に Gタンパク質を上にして組み込まれることを示唆している。この方法で GPCR分子の持つ固有ベクトルを揃えた人工膜組込を実現できる可能性が高くなった。
GPCRの特異的な位置に強く結合する大きなタンパク質を付加すれば、方向性を揃えて人工膜に組み込めると考えられるため、Rhの C末表面に結合する抗体 Fab断片を蛍光標識して、同様な実験を行った。まだ組み込み率は低いが Rh-Fab複合体も自由拡散が確認出来た。Fabは Gtと違って原理上はGPCRの任意の位置に結合して立体障害すると考えられるため、拡張性の高い技術となることが期待できる。
また、Gt/Rh複合体をナノディスクに組み込方法として、蛍光標識 Gtと可溶化Rhをゲル濾過カラムに順次投入し、カラム内で生成したRhナノディスクと蛍光標識 Gtを結合させる手法を開発した。RhナノディスクとGtが一体となって溶出し、その複合体がGTPによるGtの活性化に伴って解離することも確認出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
RhやRh*/Gt複合体をより効率よく組み込む技法を確立したい。これまでの組み込みで良好な成績を上げている手法は、リン脂質だけを含む所謂「空」ナノディスクと、Rh等を組み込んだナノディスクを適当な混合比で混ぜ、滑らかなSLBが形成されるように設計されている。現実の所、この混合比の何処で最適な組込効率が得られるかはまだ不明である。どのような脂質組成の脂質ナノディスクやRhナノディスクを使い、どのような比率で混合すれば最高の組み込み効率が実現できるかを検証すべきである。このためには、厳密に調製し、特性評価を十分に行った両ナノディスクを用意し、慎重にそれらの組み合わせや混合比を検討する必要がある。
さらに、Gtの他にRh特異性抗体Fab断片などを使って同様の方向性を持ったGPCRの組み込み技法を試みる必要もある。
これらの検討を経て、なるべく高濃度の GPCRを組み込む技法を確立し、同種あるいは異種GPCR間の膜内での相互作用によってもたらされるGPCR活性の変調など、細胞膜での情報処理研究の最先端の課題に取り組む基盤技術を確立したい。
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